[发明专利]一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法

权利要求书

1.一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：Annexin V蛋白表达纯化：

1.1：基因序列优化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，将人Annexin V基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；

1.2：Annexin V蛋白诱导表达：挑取pET28a-Annexin V质粒单菌落，接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，按照1：100将培养的菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD₆₀₀为04-0.6，取出1ml菌液作为未诱导，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，置于恒温摇床中，于28℃、150rpm/min诱导6h；

1.3：Annexin V蛋白菌液破碎：将收集的菌液离心，PBS清洗两遍，加入超声裂解液20mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH7.4重悬菌体，加入终浓度500μg/ml溶菌酶和1mM PMSF，混匀后，冰上孵育15min，冰上超声破碎仪破碎处理，超声结束后，4℃，12000rpm离心20min，收集上清溶液进行纯化；

1.4：Annexin V蛋白纯化：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化表达的Annexin V蛋白，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡层析柱，将Annexin V总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白，用PBS缓冲液，10kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后Annexin V蛋白，BCA法对蛋白定量；

步骤2：藻红蛋白(PE)巯基化：取5mg PE溶液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，加入0.1MPB重悬沉淀，pH7.2，利用脱盐柱对PE脱盐处理，脱盐后调整浓度为10mg/ml，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于DMSO中配制30mg/ml母液，按照PE与SPDP摩尔比1:30加入SPDP母液，轻轻混匀，用铝箔纸封好反应混合物，室温振荡孵育2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子，脱盐后的PE-SPDP溶液中加入DTT至终浓度50mM，轻轻混匀后，室温静止反应30min，反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；表达载体

步骤3：Annexin V蛋白衍生化：取1mg Annexin V蛋白溶液5mg/ml于1.5ml离心管中，将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于DMSO中配制30mg/ml母液，按照Annexin V与SMCC摩尔比1:30加入SMCC母液，轻轻混匀，室温振荡孵育2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；

步骤4：PE-SPDP与Annexin V-SMCC共价偶联：按照PE-SPDP与Annexin V-SMCC摩尔比1:1混合后，室温振荡孵育2h，孵育结束后每mg蛋白加入5μl N-乙基马来酰胺(NEM)，室温振荡孵育30min，终止反应；

步骤5：偶联产物纯化：先采用AKTA蛋白纯化仪进行纯化，纯化柱型号HiLoad 16/600Superdex 200pg，流动相1×PBS，pH7.4，检测波长280nm，洗脱顺序依次为Annexin V-PE、游离的PE、游离的Annexin V，由于藻红蛋白(PE)易于轴向扩散，导致分离纯化的Annexin V-PE中有少量的游离的PE，所以将收集洗脱的Annexin V-PE进一步采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化浓缩上述收集的Annexin V-PE，用平衡缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡层析柱，将上述收集的Annexin V-PE总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，用1×PBS缓冲液，50kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后偶联产物Annexin V-PE；

步骤6：偶联产物检测细胞凋亡：

6.1：集0.5-1×10⁶个HL60细胞，离心洗涤两次，弃上清；

6.2：用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟；

6.3：用预冷PBS离心洗涤，弃上清；

6.4：加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀，加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管；

6.5：单染管分别加入5μl Annexin V-PE，室温避光孵育10分钟。