[发明专利]一种从血清或血浆中提取外泌体的方法

说明书

本发明公开了一种操作简便、成本低，提取效率高、外秘体大小均匀的从血清或血浆中的提取外泌体的方法，本发明所提供的提取外泌体的方法包括以下步骤：去除细胞碎片、超速离心、上清过滤、上清加入聚沉剂、超速离心、PBS重悬沉淀。经实验表明，本发明方法提取的外泌体大小均匀，多分布在30‑80nm；其标志蛋白的含量高，并且能够去除部分杂蛋白，提高外泌体的提取效率；并且此法提取外泌体操作简单，耗时较少。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种从血清或血浆中提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNA、miRNA等生物活性物质。

虽然外泌体的功能及临床应用已经被许多研究证实，但目前简便高效提纯外泌体的方法依然是限制了外泌体的研究进展速度，目前常用的提取方法有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、PEG沉淀法、磁珠法以及膜亲和柱法等，超速离心法是外泌体提取的金标准，但超速离心法耗时耗力，并且提取率低；沉淀法虽然简单，但会同时沉淀许多杂蛋白，并且商品化试剂成本高。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供一种操作简便、成本低，提取效率高、外泌体大小均匀的从血清或血浆中提取的方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种从血清或血浆中提取外泌体的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）血清以2000×g，4℃，离心20min，去除细胞碎片沉淀，保留上清液；

2）将步骤1）中得到的上清液以30000×g，4℃，离心20min，仔细吸出上清液保留；

3)将步骤2）中得到的上清液通过截留分子量为3KD的滤膜，收集滤液；

4)向步骤3）中得到的滤液中加入沉淀剂，混匀，放置于2-8℃环境中孵育30-60min；所述的沉淀剂：滤液的重量分数比为：3-6:1；优选沉淀剂：滤液5:1。

所述的沉淀剂采用PEG2000、重水、聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、共聚维酮S-630、羧甲基纤维素（CMC）、海藻酸钠一种或几种的混合物。

其中两种沉淀剂的混合物为：PEG20000和聚乙烯醇(PVA）；PEG20000和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；PEG20000和共聚维酮S-630；聚乙烯醇(PVA）和羧甲基纤维素（CMC）；聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和共聚维酮S-630；当沉淀剂的混合物由两种沉淀剂混合而成时，两种沉淀剂的混合比例为50:1~1:50；

三种沉淀剂的混合物为：PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及共聚维酮S-630；

PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；

聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）及共聚维酮S-630；

聚乙烯醇(PVA）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）；

三种沉淀剂的混合比列为1:1:1~1:15:15；优选的混合比例为1:1:1、1:5:5、1:7:7、1:15:15。

5)将步骤4）中孵育好的样品，置于120000×g，4℃，超速离心90-120min，弃上清液，保留沉淀；

6）将步骤5）中得到的沉淀以100ulPBS重悬，分装，储存于-80℃备用。