[发明专利]一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法

权利要求书

1.一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：操作前准备；

步骤二：取出无污染的细胞观察，当观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

步骤三、消化：在培养瓶中加入胰酶替代物，每瓶1-2ml，轻摇叠加培养瓶，使每个培养瓶的消化液都能浸润培养瓶底面；

步骤四：放入37℃二氧化碳培养箱中静置1-2min后，取出培养瓶轻轻拍打，取一培养瓶到倒置显微镜下观察，待见镜下细胞变圆，大部分细胞脱落即表示消化可终止；

步骤五：将消化后培养瓶中细胞悬液转移至50ml的离心管中，然后用10ml的氯化钠注射液洗涤粘附在培养瓶中的细胞残余，并将洗涤后的细胞悬液一并转移至50ml的离心管中，定容至40-45ml；

步骤六、取样计数、计活率：将定容后的细胞悬液吹打混匀，先取不超过0.5ml的细胞悬液，进行收获细胞总数和细胞活率的计算；

步骤七、离心洗涤：将离心管配平后放入离心机离心；

步骤八、去上清、重悬细胞悬液：500g离心后将上清液去除，用适量培养基重悬离心后的细胞沉淀；

步骤九：根据最终传代T175培养瓶数量，及生物安全柜一次能放置T175培养瓶的容量，将所需T175培养瓶排成一排，竖直摆放在生物安全柜内，在瓶壁上标注细胞编码、细胞代数与培养时间等信息后，开盖，用25ml移液管加入培养基，每个21ml；

步骤十、取样并种瓶：将细胞吹打均匀后分别往每个加了21ml培养基的T175培养瓶中加入1ml细胞悬液，使每个T175培养瓶中的细胞及培养基的最终体积为22ml；

步骤十一、盖盖、平置并摇匀：加完细胞悬液后将T175培养瓶盖盖并拧紧，以3个为一摞将培养瓶平置，匀速摇晃10s，使加入细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面；

步骤十二、放入二氧化碳培养箱培养：将种瓶摇匀后的T175培养瓶以3个为一摞叠加放入二氧化碳培养箱中培养至细胞融合度达到85-90％；

步骤十三、在制备档案上及时记录相关信息。

2.根据权利要求1所述的一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法，其特征在于：在步骤一种操作前准备具体为：

S1、依次开启C级洁净室中各生物安全柜、各耗材柜及各区间的紫外灯，照射至少30min，再关闭各区间紫外灯，然后开启空间净化空调风机30min，最后关闭各耗材柜的紫外灯，使其处于运行状态；

S2、从C级洁净室的物料暂存柜中取出所需的耗材放在物料推车上，再将物料推车推至生物安全柜旁边；

S3、从物料暂存间4℃冰箱中取出培养基，放置物料推车上待其恢复至室温；

S4、取出0.9％氯化钠注射液，用喷有75％酒精的无尘布将其自瓶口向瓶底螺旋式擦拭一遍，去除瓶口塑料盖后将其放入生物安全柜中；

S5、开启0.9％氯化钠注射液瓶塞：先用止血钳夹断0.9％氯化钠注射液瓶口铝外套，再用镊子夹取75％酒精棉球，将棉球一侧固定在橡胶瓶塞与玻璃瓶口接合处，环绕一周进行擦拭，再用棉球另一侧擦拭瓶塞顶端。弃去酒精棉球，静置，待瓶口酒精挥发后使瓶口朝向水平45°，然后用止血钳夹紧橡胶塞边缘一角，止血钳勿接触玻璃瓶口，往瓶口朝向方向施力拔下瓶塞。

3.根据权利要求1所述的一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法，其特征在于：所述培养基为DMEM-F12加10％血清加10mg/ml EGF。

4.根据权利要求1所述的一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法，其特征在于：在步骤三中消化前使用氯化钠注射液轻轻冲洗细胞培养瓶1-2遍。

5.根据权利要求1所述的一种公库脐带间充质干细胞工作细胞传代扩增方法，其特征在于：在步骤六中细胞总数和细胞活率的计算步骤如下：取0.5ml的细胞悬液加0.4％台酚蓝染液0.5ml，用吸管轻轻吹打混匀，染色2-3min后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的死细胞数，计算活细胞占细胞总数的百分比即为细胞存活率。