[发明专利]用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用。所述筛选方法包括以下步骤：对各个供试品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定；将所得数据导入Proteome Discoverer分析软件，采用Uniprot的数据库Testudines进行搜库匹配，采用SEQUEST检索算法，筛选获得用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合。本发明利用液质联用技术，结合蛋白组学，找出能用于区别中华鳖鳖甲与乌龟龟甲、佛罗里达鳖和角鳖的特征多肽，专属性强，操作简便，为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片及两者标准汤剂的质量控制和评价提供依据。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，特别是涉及用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用。

背景技术

鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。鳖广布于全国各地，多生活于湖泊、小河及池塘旁的沙泥里。全年均可捕捉，以秋、冬二季为多，捕捉后杀死，置沸水中烫至背甲上的硬皮能剥落时，取出，剥取背甲，除去残肉，晒干。具滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结等功效，用于阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，手足瘈疭，经闭，癥瘕，久疟疟母。现代药理学研究表明，鳖甲能提高血浆蛋白的水平，增强机体免疫力，促进肝细胞的修复与再生。醋鳖甲具有收敛、解毒、散瘀止痛的作用，还能增强药物入肝消积，软肝散结的能力。

然而，鳖甲作为一种常用中药，针对其质量标准的研究并不完善。2020年版《中国药典》一部仅对鳖甲的性状、水分和浸出物进行控制，未在鉴别方面作出规定。关于鳖甲及其制品(例如醋鳖甲及其标准汤剂、鳖甲标准汤剂)的研究也大多集中在化学成分和药理方面，定性方面的报道较少。目前，鳖甲的鉴别主要依据药材性状、紫外光谱、薄层和聚合酶链反应(PCR)技术，如卢先明的《鳖甲的品种与鉴别研究》、李莉的《浅析鳖甲及其伪品的鉴别》以及吴平的《用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲》，但紫外光谱和薄层鉴别缺乏专属性。虽然PCR技术特异性强、灵敏度高，但是鳖甲标准汤剂的提取过程温度较高，特定的DNA片段可能遭到破坏，加上基质复杂，提取更为困难，导致PCR技术难以应用到的鳖甲标准汤剂之中。

近年来，随着蛋白组学与液质联用技术的结合，有些研究成功地通过寻找动物药的特征肽段进行真伪鉴别和基原区分，如房芳的《基于特征肽段的阿胶中异源性物种鉴别》中，为鉴别阿胶中动物源性掺假物，结合鸟枪蛋白组学技术对不同物种的热稳定特征肽进行检测和鉴定。但其研究的对象为阿胶。在鳖甲胶方面，刘宇文的《液质联用多肽识别技术鉴别鳖甲胶的研究》找出了鳖甲胶与龟甲胶、鹿角胶、阿胶、黄明胶、新阿胶、佛罗里达鳖甲胶、山瑞鳖甲胶的差异性特征肽段，从而建立专属性的鉴别方法。然而，《液质联用多肽识别技术鉴别鳖甲胶的研究》找出的鳖甲胶的特征离子为m/z 784.90(双电荷)，鉴定序列为GETGPVGVTGSVGPAGAR，将此序列进行Uniprot BLAST搜索，结果显示共有249个蛋白拥有一致或相似的肽序列。因此，可能存在未在上述文献列举的其他物种可能与鳖甲胶拥有一致序列的情况。而且，随着角鳖等非药用鳖甲类动物养殖、龟甲等龟甲类动物养殖已经获得成功，有可能出现使用这些品种混充正品中华鳖鳖甲的现象，因此上述文献的检测方法有一定局限性。

发明内容

基于此，本发明提供一种用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法，利用液质联用技术，结合蛋白组学，找出能用于区别中华鳖鳖甲与乌龟龟甲、佛罗里达鳖和角鳖的特征多肽，专属性强，操作简便，为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片及两者标准汤剂的质量控制和评价提供依据。

本发明所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法，包括以下步骤：

分别制备中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液；