[发明专利]一种毛发中毒品快速检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括毛发消化液，所述的消化液包括处理液A和处理液B，所述的处理液A包括角蛋白酶、蛋白酶K、DTT和氢氧化钠，处理液B包括盐酸。

2.根据权利要求1所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶1-200μg/mL，蛋白酶K1-200μg/mL，DTT 10-100μmol/mL，氢氧化钠0.01-0.5mol/L，所述的处理液B包括盐酸0.01-0.5mol/L。

3.根据权利要求2所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶5-100μg/mL，蛋白酶K5-100μg/mL，DTT 20-80μmol/mL，氢氧化钠0.04-0.4mol/L，pH 11-12，所述的处理液B包括盐酸0.04-0.4mol/L，pH 2-3。

4.根据权利要求3所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶30-50μg/mL，蛋白酶K30-50μg/mL，DTT 30-40μmol/mL，氢氧化钠0.05-0.2mol/L，pH 11.5-12，所述的处理液B包括盐酸0.05-0.2mol/L，pH 2-2.5。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒还包括：抗原-BSA包被的酶标板、试剂一：生物素标记的特异性抗体冻干粉、试剂二：Streptavidin-HPR冻干粉、标准品、洗涤液、溶解液、显色液、终止液。

6.根据权利要求5所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，

所述的抗原-BSA的制备方法如下：按质量比1:3分别取甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮和K₂CO₃，按照料液比20mg:1mL溶解于甲苯中，在氮气保护下，按照甲苯:溴乙酰溴体积比为40:1，向上述溶液中缓慢加入溴乙酰溴，常温搅拌4-6h，将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，将含有BSA的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得抗原-BSA；

所述的抗原-BSA包被的酶标板的制备方法如下：用0.01-2.5μg/mL抗原-BSA溶液包被96孔板，4℃过夜，抗原-BSA溶液的浓度优选为0.01-1.0μg/mL，优选为0.1-0.5μg/mL；次日用脱脂牛奶在37℃条件下封闭96孔板2h，用洗涤液洗板3次，拍干后冷藏4℃备用；

所述的生物素标记的特异性抗体的制备方法如下：

1)动物免疫与血清效价的测定：取一定量的抗原甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮稀释至适宜浓度，加入等量的弗氏佐剂，用注射器来回抽吸充分乳化，取6周龄左右的Balb/c小鼠，采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，免疫间隔两周，待小鼠效价达到融合要求后，直接腹腔注射50μg抗原进行加强免疫；

2)骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤SP2/0细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基培养SP2/0细胞，每天更换新鲜培养基使成为对数分裂期生长旺盛的细胞，融合前将SP2/0细胞用含8-氮鸟嘌呤的完全培养基进行培养传代4-5次，防止SP2/0细胞的反祖，保证细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型，防止对融合后杂交瘤细胞的筛选带来的影响；

3)杂交瘤细胞的筛选：取免疫鼠脾脏，分离淋巴细胞，与SP2/0细胞在50％PEG溶液的条件下以1:10的比例进行融合，经选择培养液培养后，将效价高的细胞进行亚克隆分离得到分泌抗体的单克隆细胞株，将培养状态良好的阳性细胞株进行小鼠体内诱生产生抗体，纯化抗体；

4)抗体生物素标记：采用生物素标记试剂盒标记纯化后的单克隆抗体；

所述的生物素标记的特异性抗体冻干粉的制备方法如下：

取0.5-5μg/mL生物素标记的特异性抗体加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h；

所述的Streptavidin-HPR冻干粉的制备方法如下：

取0.5-5μg/mL Streptavidin-HPR加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h；

所述的冻干保护剂包括：脱脂牛奶，海藻糖10-200mg/mL，乳糖10-200mg/mL，右旋糖苷10-200mg/mL，牛血清白蛋白10-200mg/mL中的一种或几种的混合物；

所述标准品包括甲基苯丙胺标准品、吗啡标准品或氯胺酮标准品，所述甲基苯丙胺标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述吗啡标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述氯胺酮标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL；

所述洗涤液为0.15M PBS，制备方法如下：KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄-12H₂O 2.9g，NaCl8.0g，KCl 0.2g，0.05％Tween-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL；

所述溶解液为将所述洗涤液调至pH 6.0，在该洗涤液中加入脱脂牛奶，使脱脂牛奶在洗涤液中的浓度为0.01g/mL；

所述显色液为TMB显色液；

所述终止液为2M H₂SO₄，制备方法如下：蒸馏水178.3mL，逐滴加入98％浓硫酸21.7mL。