[发明专利]一种快速诊断蜜蜂丝状病毒试纸及其应用

说明书

本发明提供了一种蜜蜂丝状病毒抗体胶体金快速检测试剂条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗原。本发明的试纸条特异性强，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中复杂的病毒处理操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需20min极为迅速。

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，涉及胶体金以及金标抗体复合物，尤其涉及蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白抗体的检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法以及应用。

背景技术

蜜蜂丝状病毒（Apismellifera filamentous virus，AmFV），最初被误认为是蜜蜂立克次氏体病，随着后来进一步的研究发现它是一个大的囊膜双链DNA (dsDNA)病毒。其丝状核蛋白折叠成三个重叠的“8”环状，形成一个450 nm×170 nm的病毒粒子。由于蜜蜂丝状病毒（AmFV）具有基因组大、隐性感染、流行广泛等特点，近年来逐渐受到各国科学家的关注。但该病毒的研究进展缓慢，2015年才完成第一株（瑞士株）基因组的测序工作。病毒蛋白主要包括核衣壳蛋白和囊膜蛋白。

AmFV感染的一个主要诊断特征是，严重感染的成年蜜蜂的血淋巴由于细胞降解和大量病毒粒子的存在而变成奶白色。AmFV已在美国、英国、瑞士、法国、墨西哥、叙利亚、非洲、中国等地区的意大利蜜蜂及中国地区的中华蜜蜂中被报道，并都具有较高的流行率。另有报道称蜜蜂丝状病毒在中国意大利蜜蜂的流行率（90%）明显高于在中华蜜蜂中的流行率（52%）。分子诊断表明，AmFV病毒在蜜蜂蜂群中是广泛存在的，既可以通过食物交换进行水平传播，又可以通过蜂王到子代工蜂的垂直传播。目前，对于AmFV的检测主要是通过对蜜蜂血淋巴样品的电子显微镜检查和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）。这些方法存在一些较难克服的缺点，例如：PCR法需要若干个试剂、且需要特殊的仪器，检测步骤较为繁琐，检测所需的时间较长，而显微镜检测过程中还需其它设备与仪器，并且对于在实地情况下的蜂农来说，对技术要求也是一个重要的难题，整体所需的花费也较高。因此迫切需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。因此，开发建立一种可以对蜜蜂丝状病毒抗体检测快速有效的方法是十分必要的。目前没有任何关于蜜蜂丝状病毒的抗体检测法，而免疫胶体金技术是20 世纪80 年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，目前已广泛应用于临床诊断, 尤其是在医学、兽医学临床检验中已广泛应用，具有费用低、灵敏度高、检测速度快、使用便捷和易于普及等特点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种蜜蜂丝状病毒（AmFV）抗体胶体金快速检测试纸条。

本发明提供的检测纸条，其包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的鼠源多克隆抗体；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有抗蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白的兔源多克隆抗体，所述质控带固定有蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白。所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白序列如序列表中序列2所示。

所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述蜜蜂丝状病毒囊膜蛋白白；所述表达载体优选为PET-28a载体。

其中，所述的支撑层优选为聚乙烯纤维板，更优选为聚氯乙烯板（Polyvinylchlorid PVC 板），其中，所述的加样垫优选为中速定性滤纸。

其中，所述的金标抗体释放垫优选为玻璃纤维素膜，更优选为Rapid27（美国Whatman）的玻璃纤维素膜。