[发明专利]一种评价转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法

说明书

本发明公开评价转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法，配制转基因外源蛋白稀释液；将玉米芯粉碎研磨，高温高压灭菌得到玉米芯粉末；将玉米芯粉末加入到蛋白稀释液中，在离心管中充分震荡混匀，静置，离心，取出上清液；将上清液重新加入离心管，重复多次；最后离心得到的沉淀即为吸附好蛋白的玉米芯粉；取蛴螬置于底部铺满土壤的小烧杯中，饲喂吸附好蛋白的玉米芯粉、空白玉米芯粉以及辛硫磷乳油浸泡后的玉米芯粉组，置于培养箱中饲养，观察蛴螬存活情况与体重变化情况评价转基因外源蛋白对蛴螬的影响。本发明对尚未应用于作物的多种新型转基因外源蛋白均能够有效检测其对蛴螬的影响，具有很强的实用性。

技术领域

本发明属于转基因植物环境安全评价技术领域，具体涉及一种评价转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法。

背景技术

截至2018年共有70个国家种植或进口了转基因作物，这已是全球连续应用转基因作物的第23个年头。26个国家共种植了1.917亿公顷转基因作物，比2017年的种植面积增加了190万公顷。世界转基因棉花种植面积已约2500万公顷，占所有棉花种植的78％，这其中带有Bt基因的棉花占据相当比例。在中国，转基因棉花和番木瓜也早已实现了大规模商业化种植，产生了良好的生态和经济效益。但关于转Bt基因作物对非靶标动物的安全性一直存在争论，因此对于转基因作物的非靶标动物的生物检测，是转基因作物安全评价工作中非常重要的环节。

蛴螬是金龟甲的统称。鞘翅目，金龟子总科。在中国汉初解释词义的专著《尔雅》中即有记载。全世界已知数万种，中国已记载约1000余种。是重要地下害虫也是是土壤生态环境中重要的食物链环节和土壤代谢的参与者。此外某些种类的蛴螬可入药，对人类有益。近年来，蛴螬的经济价值逐渐被开发，其体内富含多种营养物质，被誉为“蛋白质饲料宝库”，成为新兴的经济昆虫，饲养规模逐渐扩大。

对于已经商业化的转基因作物，我们用其茎叶组织喂饲蛴螬，可以评价转入的外源蛋白对蛴螬的影响。而对于大多数尚未转入作物中的新型转基因外源蛋白，无法采用饲喂茎叶的方法来评价其对蛴螬的影响。因此，建立适用于评价新型转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法，是评价新型外源蛋白对蛴螬影响的重要手段，也是新型外源蛋白能否继续下一步应用的关键环节。

发明内容

发明目的：为了能够评价转基因外源蛋白对于蛴螬的影响，本发明所要解决的技术问题是提供了一种评价转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种评价转基因外源蛋白对蛴螬影响的生物检测方法，包括以下步骤：

1)配制转基因外源蛋白稀释液；

2)将玉米芯粉碎研磨成粒径小于100微米的颗粒，用纯净水洗净，高温高压灭菌得到玉米芯粉末；

3)将步骤2)处理好的玉米芯粉末加入步骤1)得到的蛋白稀释液中，在离心管中充分震荡混匀，静置，离心，取出上清液；

4)将上清液重新加入步骤3)中的离心管，重复步骤3)多次；

5)最后离心得到的沉淀即为吸附好蛋白的玉米芯粉，取出备用；

6)上清液用于蛋白含量测定，以确定蛋白实际吸附量；

7)取蛴螬置于底部铺满土壤的小烧杯中，土壤为灭菌农田土或人造土壤，厚度2-5cm，饲喂吸附好蛋白的玉米芯粉、空白玉米芯粉以及辛硫磷乳油浸泡后的玉米芯粉组，置于培养箱中饲养，观察蛴螬存活情况与体重变化情况评价转基因外源蛋白对蛴螬的影响。

其中，所述步骤1)中的转基因外源蛋白包括但不仅限于Cry 2Ab蛋白或Cry3A蛋白，其他的转基因外源蛋白也可以用于该检测方法。

其中，所述步骤1)中的转基因外源蛋白的浓度为0.1～1mg/ml。

其中，所述步骤3)中的玉米芯粉末与蛋白稀释液的固液比为1∶5～1∶20g/mL。