[发明专利]一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法

说明书

本发明提供了一种改进的诱导胚胎干细胞生产红细胞的方法，所述方法通过优化培养和诱导步骤，特别是加入诱导肽以及miRNA之后，使得诱导得到的红细胞的生理特性与正常红细胞接近，通过小鼠模型验证了所述红细胞的生物学功能，证明了本发明诱导分化得到的红细胞可以用于商业化应用，具有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及制药领域，更具体的涉及一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法。

背景技术

据WHO统计，每年全世界输血达9000万次以上。目前红细胞和其他血液制品主要来源于志愿者外周血捐献，但世界上仍有73个国家的献血率不能满足一个国家的最基本血液需求。全世界每年有数百万需要输血的患者因不能及时获得安全血液而死亡。另外，由志愿者捐献的血液制品存在着一些不安全因素，其中首推通过血液途径传播的病原微生物及其代谢产物的污染，因此安全用血仍是全球性问题。据估计全世界每年因输入不安全血液而导致的乙型和丙型肝炎病毒感染新发病例为上千万例。在二十世纪八十年代中以及九十年代初期，因不安全输血导致艾滋病毒感染的比率高达10％。此外，稀有血型的供者缺乏问题给输血带来新的挑战。

多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和近年兴起的诱导性多能干细胞在体外可以无限制复制和扩增，并且理论上在特定条件下可以定向分化为人体所有的组织细胞，为人类再生医学和细胞替代治疗提供了永不枯竭的无需供者的细胞来源。

多能干细胞向红细胞诱导分化是一个持续诱导，逐步成熟的过程，包括中胚层的诱导、造血内皮转换、造血系的定向，再到红系祖细胞形成，最后是红细胞分化和成熟。目前以多能干细胞诱导为红细胞主要有两个途径，即与基质细胞共培养法和拟胚体(EB)形成法。拟胚体法是指在特定的诱导条件下，多能干细胞在悬浮培养条件下聚集分化形成的由三个胚层细胞组成的立体结构，这其中也包括造血细胞，在EB形成过程中，添加特定的细胞因子可促进多能干细胞向中胚层分化，提高相应造血干细胞的比例。基质细胞共培养法是将造血微环境来源细胞与多能干细胞共培养，为多能干细胞向造血干细胞和红细胞分化成熟提供多种促进因子。二者均模拟体内造血发生过程，首先获得源于多能干细胞的造血干细胞，再将造血干细胞进一步诱导分化，最终得到较成熟的红细胞。

干细胞诱导成红细胞是指以胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)或造血干细胞(HSC)为材料，在体外经过一系列诱导分化，使其产生红细胞的过程。 1993年Keller等首次从ESC中分离出红细胞集落；随后他们开始尝试在含有促红细胞生成素和细胞因子的培养基中人工造血。2010年起，iPSC作为遗传性红细胞生成障碍性血液病的治疗手段开始在临床上逐渐发挥作用；由于iPSC能够有效避免ESC使用时的伦理问题，并且在生成效率和体外培养成本等方面具明显的优越性，iPSC体外培养生成红细胞已经成为大多数研究中的主要干细胞来源。同样，HSC用于诱导生成红细胞的研究也在进行中，由粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血(peripheral blood，PB)或脐带血(umbilical-cord blood，UCB)2种不同途径获得的HSC在多项研究中被证明能够最终诱导分化为成熟红细胞。1993年,Wiles实验室通过EB分化实验得到了成熟的小鼠红细胞。在ESC分化培养后的8天得到的EB加入细胞因子促红细胞生成素 (erythropoietin,EPO)和KL(Kit-Ligand)继续培养10到14天得到了大部分红细胞的克隆。1997-1999年,Lindern和Wessely等陆续报道了人工合成的类糖皮质激素地塞米松(dexamethasone)在红细胞前体细胞的自我更新过程中发挥重要作用。2004年,Beug实验室通过三步法将EB分化得到的红细胞前体细胞扩增到107倍。

红细胞生成是受多因素调节的个体分化发育的重要生理过程。迄今，微小R NA的发现和功能研究证实miRNA可通过多种形式调控基因表达，在红细胞生成过程中扮演重要角色，与红系生成分化相关。研究表明上调miR-451可体外诱导小鼠胚胎干细胞红细胞分化成熟，无需细胞因子的刺激作用即可促进人红细胞生成增多。miR-4732-3p抑制SMAD2/4依赖性TGF-β信号传导，从而促进红细胞分化过程中的细胞增殖。