[发明专利]一种促进胚胎干细胞增殖和分化的方法

权利要求书

1.一种诱导胚胎干细胞生成红细胞的方法，其特在于所述方法包括以下步骤：

取对数增长期的HES3.1细胞，弃培养液，用 EBSS 液洗一遍，加入 4mlEBSS液和 1ml浓度 5mg/ml 的 IV 型胶原酶，37℃消化 10min，镜下见细胞集落间边界清晰，集落内部细胞松解开，弃消化液用 EBSS 洗一遍，添加 ES 细胞培养液，反复吹打皿底，细胞脱落并分散成大小均匀的小细胞片，以 1：8 比例接种于种好 MEF 细胞的培养皿中，置于 37℃、含6%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待生长形成EBs后，将 EBs 移入离心管中 200rmp/min 离心 4min，弃去上清，用培养液重悬细胞 EBs，培养液组成为20%终浓度的血清替代物、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、 NEAA终浓度0.01%、bFGF 4ng/ml、10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mL SCF；将细胞置于细胞培养箱中培养。将培养4d天的EBs 接种于胎肝基质细胞饲养层上进行诱导培养4天，培养基为20%终浓度的血清替代物、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml、L-谷氨酰胺2mM、NEAA终浓度0.01%、bFGF 4ng/ml、10ng/ml BMP4、20mg/ml IL-3、10ng/mL SCF、5 ng/mL hVEGF、10 ng/mL hBMP4、100ng/mL hSCF、20 ng/mL hIL-6、2 U/mL hEPO、40 ng/mL hIL-3、10ng/mL IL-11和10ng/mL Flt3-L、50ng/mL的诱导肽YEDPKSPRRHNQVPSMVT；将诱导4天后的细胞群消化，使用si PORT Neo FX 转染试剂将miR-705转染所述细胞，收集阳性细胞用 Stemline II造血培养基重悬细胞，取 1.5×10⁵个细胞悬液与3 mL 含有50 ug/mL的VEGF，25 ug/mL的Flt3ligand，8 ug/mL的bFGF，1%的青霉素和1%的链霉素Stemline II造血培养基震荡混匀；随后，将液体接种到低吸附细胞培养皿中，培养在 37ºC，5%CO₂的培养箱中培养5d，在细胞培养皿内添加 2 mL 培养基组成为50 ug/mL的VEGF，25 ug/mL的Flt3ligand，8 ug/mL的bFGF，1%的青霉素和1%的链霉素的Stemline II造血培养液，此时需注意不能搅动培养液中细胞克隆，将细胞放入培养箱中孵育3d，添加与培养皿内添加等体积的组成为3 units/mL的EPO，50 ug/mL的VEGF，25 ug/mL的Flt3ligand，8 ug/mL的bFGF，1%的青霉素和1%的链霉素的Stemline II造血培养液，继续放置在培养箱内3d。将培养皿内的液体转移至低吸附细胞培养皿，并加入与培养皿内液体等体积的含有50 ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液，置于培养箱内孵育5d；随后加入 1/2 培养皿内液体体积的组成为0.5%的MC，50 ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液；每 3 d 更换一次，共更换2次。随后加入培养皿内液体 5 倍体积的 IMDM 培养基,离心收集细胞。用IMDM 培养基润洗细胞 2次，并用含 0.5% BSA 的 IMDM 重悬细胞，将其接入组织培养瓶中过夜培养。收集组织培养瓶内的细胞，用含有 50 ng/mL的SCF，3 unit/mL的EPO的Stemline II造血培养基的培养液重悬细胞，保持细胞密度在 2×10⁶cells/mL，每 2 d 换液一次，换2次后，收集培养皿内的细胞，用含有3 unit/mL EPO 的StemPro^TM-34培养基培养液重悬细胞，放入细胞培养箱中继续诱导 5d即获得相应的诱导红细胞。