[发明专利]一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法

说明书

本发明提供了一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，包括如下步骤，1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×10supgt;4/supgt;‑1×10supgt;6/supgt;个细胞。本发明所述的方法有效的缩短了转基因乳腺生物反应器制备的周期，而且成本低，效率高，操作相对简单。外源基因对动物本身的影响较小，而且外源基因也不会遗传到后代，生物安全性也相对较高。

技术领域

本发明属于生物反应器技术领域，尤其是涉及一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法。

背景技术

动物生物反应器是利用转基因活体动物,在其器官或组织中高效表达某种外源蛋白,并进行工业化生产功能蛋白质的技术。根据目的蛋白表达部位的不同,可分为乳腺、血液、蛋清、尿液、精囊腺、唾液腺等生物反应器。由于乳腺有高表达重组蛋白以及翻译后修饰的能力，乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化的生物反应器。自1987年首次构建转基因小鼠乳腺生物反应器，并成功提取出组织型纤溶酶原激活剂以来，利用生物体生产重组蛋白质药物的新时代正式开启，以转基因动物为核心技术的生物制药公司相继建立。

用于生产外源蛋白的系统有很多种，比如多细胞生物，植物和动物，而目前转基因家畜的乳腺生产外源蛋白是比较常用的系统。这种制备乳腺生物反应器的技术方法都是将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，从而获得转基因动物，利用雌性动物产仔后乳腺分泌乳汁的特点，在乳汁中源源不断地获得外源性蛋白。然而这一技术方法的缺点非常明显，主要包括技术操作要求高，周期较长以及费用较高，转基因动物出生效率低，外源基因在动物体内存在非定点整合的风险，外源基因在动物乳腺中特异性表达效率低，动物伦理以及生物安全性风险等问题。且转基因动物的生产周期较长，因此，需要一个新的方法去弥补相应不足。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，本发明利用体细胞转分化获得的功能性乳腺上皮细胞建立一种制备新型转基因乳腺生物反应器的简单且高效的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法，包括如下步骤，

1)制备携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞；

2)将步骤1)制备的携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞注射到去除了乳腺芽的乳腺脂肪垫，注射细胞量为5×10⁴-1×10⁶个细胞。

优选的，步骤1)的外源基因为绿色荧光蛋白GFP。

优选的，携带外源基因的转分化乳腺上皮细胞的制备包括如下步骤，采取奶山羊耳尖组织进行分离培养获得成纤维细胞GEFs；然后将慢病毒重组质粒psin-Ef1a-GFP-puro与慢病毒包装载体VSVG和NRF共转染293T细胞，转染48-72h后收集病毒悬液，用于感染山羊成纤维细胞；后续用嘌呤霉素进行筛选，获得稳定表达GFP的山羊成纤维细胞GFP-GEFs；再使用小分子化合物对GFP-GEFs进行诱导获得携带绿色荧光蛋白GFP的小分子化合物诱导转分化山羊乳腺上皮细胞GFP-CiMECs；优选的，嘌呤霉素的浓度为1-6μg/ml。

优选的，所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、RepSsox、SB431542、SB525334、SB505124、LDN-193189、LDN-214117、LDN-212854、K02288、A-83-01、SP600125、SB20358、LY2157299、LY2109761、BIBF-0775、TP0427736HCL、SD-208、Vactosertib中的一种或两种以上。

优选的，步骤2)中，裸鼠乳腺芽部位脂肪垫MFP的清除包括如下步骤，