[发明专利]一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用

说明书

本发明公开了一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用。所述的烟草受体蛋白基因包括NtCOI1‑1和NtCOI1‑2，其核苷酸序列如SEQ ID:NO.1和SEQ ID:NO.2所示。克隆方法包括烟草根cDNA合成：提取烟草根总RNA，反转录得到第一链cDNA；NtCOI1‑1、2基因的PCR扩增：以烟草根cDNA为模板，根据NtCOI1‑1、2基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。应用为所述的烟草受体蛋白基因NtCOI1‑1、2在调控烟草烟碱含量的转基因烟草植株中的应用。本发明利用CRISPR/CAS9技术对克隆的NtCOI1‑1、2基因进行了功能鉴定。烟草NtCOI1‑1、2基因的克隆鉴定为调控烟草烟碱含量提供了新的靶标基因。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用。

背景技术

烟碱是栽培烟草中特征性化合物，深刻影响卷烟品质。烟碱的合成受到植物激素的调控，比如生长素，乙烯以及茉莉酸。其中茉莉酸调控烟碱合成途径的研究较为清晰。在无茉莉酸的情况下，JAZ蛋白结合MYC2蛋白从而抑制MYC2蛋白激活烟碱合成途径基因的功能。在茉莉酸存在的情况下，茉莉酸通过结合受体蛋白COI1激活JAZ蛋白的降解(通过26S蛋白酶途径)，JAZ蛋白的降解释放MYC2，从而激活烟碱合成途径相关基因，提高烟叶烟碱含量。

通过基因手段调控烟碱含量已有较多的研究，比如通过过量表达转录因子基因，如ERF,MYC2等能够显著提高烟叶烟碱含量；通过RNA干涉技术降低烟碱合成途径基因，如QPT等能够显著降低烟叶烟碱含量。近年来，基因组编辑技术也应用于调控烟碱含量，比如敲除BBL家族基因获得烟碱含量极低的烟草。

随着新型烟草制品的迅猛发展，市场对不同烟碱含量烟叶的特殊化需求日益增加，其中包括低烟碱含量烟草。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草受体蛋白基因；第二目的在于提供所述的烟草受体蛋白基因的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草受体蛋白基因的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草受体蛋白基因包括NtCOI1-1和NtCOI1-2，其核苷酸序列如SEQ ID:NO.1和SEQ ID:NO.2所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、提取烟草根部组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、以cDNA为模板，根据烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和烟草受体蛋白基因NtCOI1-2序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；

C、纯化扩增产物与载体链接，具体过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL-BluntⅡ-TOPO(Invitrogen)混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草受体蛋白基因在获得调控烟草烟碱含量的转基因烟草植株中的应用。

本发明还提供一种利用CRSIPR/CAS9编辑技术对烟草NtCOI1-1、2基因进行功能鉴定的方法，具体包括以下步骤：

(1)构建CRISPR/CAS9载体

A、根据NtCOI1-1、2基因组序列设计CRISPR/CAS9靶位点(PAM)，即GAATTGGTTGCGATGAATCGGGG。