[发明专利]一种烟草受体蛋白基因及其克隆方法与应用

权利要求书

1.烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和NtCOI1-2在获得调控烟草烟碱含量的转基因烟草植株中的应用，NtCOI1-1和NtCOI1-2的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1和SEQ ID:NO.2所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID:NO.3和SEQ ID:NO.4所示；其特征在于，利用CRSIPR/CAS9编辑技术敲除烟草植株中NtCOI1-1和NtCOI1-2，获得的转基因烟草植株的烟叶中烟碱含量比野生型植株显著降低。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和NtCOI1-2的克隆方法包括以下步骤：

A、提取烟草根部组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、以cDNA为模板，根据烟草受体蛋白基因NtCOI1-1和烟草受体蛋白基因NtCOI1-2序列设计正反向引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物；所述的正反向引物为：

NtCOI1-1F：5’- ATGGAGGAGCGTAGCTCCACTC-3’

NtCOI1-1R：5’- CTATTCAGCGAGAAGGAAATTTGG-3’；

NtCOI1-2F：5’- ATGGAGGAGCGTAGCTCCACG -3’

NtCOI1-2R：5’- CTATTCAGCGAGAAGGGAATTTG-3’；

C、纯化扩增产物与载体连接，具体过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B步骤中所述的PCR反应体系为：总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B步骤中所述的PCR扩增的反应程序为： 98℃，30秒；98℃，7秒；66℃，30秒；72℃，60秒；35个循环；72℃延伸7分钟。