[发明专利]一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用。其制备方法包括将CaIFN‑α进行氨基酸位点突变成犬α干扰素突变体CaIFN‑α‑Mut，CaIFN‑α、CaIFN‑α‑Mut以及蛋白标签合成之前分别进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至表达载体得到重组质粒，之后经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到目的蛋白即犬α干扰素重组蛋白。解决了现有犬α干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题，在大规模生产中能够极大降低生产成本。

技术领域

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

犬α干扰素(CaIFN-α)是一种具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性的蛋白，抗病毒活性为犬α干扰素的主要生物学活性，广泛用于犬病毒性疾病的防治，包括：犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬腺病毒、犬副流感、犬冠状病毒感染、犬疱疹病毒感染、犬病毒性角膜炎及其他病毒性疾病。其作用机制为犬α干扰素通过一系列的信号传导刺激机体产生ISG(干扰素刺激基因)产物，ISG类产物包括多种抗病毒蛋白，能够有效抑制病毒的复制。同时还可通过提高机体的免疫效应和调整病毒转录过程等有效方式来实现其抗病毒作用。天然干扰素包括CaIFN-α具有半衰期短的特性，为4h左右，而现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。

现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。犬α干扰素的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达系统中的表达，在大肠杆菌表达系统缺少将蛋白质有效的释放分泌机制，面临产量小、表达形式为包涵体的问题，存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺；同时大肠杆菌表达系统无法有效形成二硫键，不利于犬α干扰素的正确折叠，影响其天然构象及稳定性，进而影响其生物学活性；利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况，在相应表达系统中由于蛋白的翻译折叠等过程中还普遍存在表达的犬α干扰素生物活性低的现象。

在长效性修饰的研究中，血清白蛋白修饰、蓖麻毒素B链、GST等技术均有利用来融合犬α干扰素，融合表达时易出现断裂、酶降解及影响犬α干扰素活性等问题，在不同表达系统中融合蛋白的选择是一个技术性难题。

在犬病毒病预防方面，国内运用较多的是疫苗和抗体，但是由于母源抗体的干扰及毒株的抗原漂移，有时会导致免疫失败，因此研制安全高效的干扰素抗病毒制剂具有重大意义。犬α干扰素具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性。但其自身的半衰期短及现有技术限制了犬α干扰素的临床应用。如何提高其自身的生物学活性、延长半衰期、探索一条高效的表达系统对犬α干扰素的临床应用具有广阔的前景。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用，形成一种生物学活性高、半衰期延长、稳定性好、不易降解的犬α干扰素突变体。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种高活性的犬α干扰素重组蛋白，所述犬α干扰素重组蛋白的融合片段包括采用犬α干扰素或者犬α干扰素突变体，所述犬α干扰素重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～4所示；

所述犬α干扰素突变体为CaIFN-α(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示)进行氨基酸位点突变形成的CaIFN-α-Mut；所述犬α干扰素突变体为CaIFN-α进行氨基酸位点突变形成的CaIFN-α-Mut，所述突变的氨基酸包括犬α干扰素的第150～164位点的1个或2个氨基酸，所述通过对犬α干扰素的氨基酸位点的突变可以增强生物学活性，所述突变位点为通过分析犬α干扰素的氨基酸选择得到；