[发明专利]稀有鮈鲫载脂蛋白ApoE基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用

权利要求书

1.一种稀有鮈鲫ApoE基因，其特征在于，所述基因命名为GrApoE，其核苷酸序列如SEDID NO：1所示。

2.一种稀有鮈鲫ApoE密码子优化基因，其特征在于，为GrApoE的核苷酸序列SED IDNO：1经过密码子优化后的序列，其核苷酸序列如SED ID NO：2所示。

3.一种稀有鮈鲫ApoE重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SED ID NO：3所示。

4.一种多克隆抗体，其特征在于，是以权利要求3所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白为抗原，免疫动物制备所得。

5.权利要求3所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白/权利要求4所述多克隆抗体在ApoE检测中的应用。

6.权利要求3所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

构建重组质粒：将稀有鮈鲫ApoE密码子优化基因序列SED ID NO：2连入pET30a表达载体得到pET30a- GrApoE重组质粒；

重组蛋白的诱导表达：将pET30a- GrApoE重组质粒转化入大肠杆菌中，培养，诱导，裂解，纯化，得到稀有鮈鲫ApoE重组蛋白。

7.根据权利要求6所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白的制备方法，其特征在于，重组蛋白的诱导表达包括：向大肠杆菌感受态细胞BL21加入pET30a- GrApoE重组质粒，混匀后涂布至固体培养基进行培养，得到含有重组质粒的大肠杆菌的菌落；挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入液体培养基震荡培养，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导培养，得到GrApoE-His重组蛋白粗产物，收集菌体，用超声破碎仪将细菌裂解，最后进行重组蛋白的纯化，即得；

和/或，纯化包括：取一定量诱导培养后的菌体，进行固液分离，收集菌体，再将经超声破碎后裂解的菌体，得上清及沉淀，再将上清样品使用硫酸铵盐后进行Ni²⁺离子亲和层析柱纯化，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液；用15倍柱体积的结合缓冲液洗涤Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白；使用5 mL洗脱液再进行洗涤柱子，出现目的蛋白峰时，收集含有目的蛋白的洗脱液。

8.权利要求4所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，以权利要求3所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。

9.根据权利要求8所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：将所述的稀有鮈鲫ApoE重组蛋白作为抗原注入兔子体内，四次免疫后，采集兔血，分离血清，纯化后得到稀有鮈鲫ApoE蛋白抗兔多克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将稀有鮈鲫ApoE重组蛋白浓度调整为1mg/mL作为抗原注射；佐剂和抗原为1:1体积比抽取；首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。