[发明专利]粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法

说明书

本发明提供了一种粘蛋白以及循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，涉及癌症检测技术领域，包括以下步骤：QDs选择性识别Ag⁺和C‑Ag⁺‑C的现象；选择性识别反应在mucin 1和CTCs可视化和荧光检测中的应用；核酸序列的设计。本发明的检测方法具有以下优点：选择mucin 1作为CTCs新型标志物；均相策略，简化操作步骤，易于实现；使用无酶核酸信号放大技术，可在室温下操作和反应；采用发光纳米材料作为信号分子，实现可视化快速分析；使用低成本高亲和力的核酸适配体作为识别探针，无酶核酸信号放大，均相操作，发光纳米材料作为信号分子，其成本可极大地降低。

技术领域

本发明涉及癌症检测技术领域，尤其是涉及一种粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法。

背景技术

恶性肿瘤对人类的生产生活带来了极大地影响，其活跃生长的肿瘤通常会向外周血中释放循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，简称CTCs)。越来越多的证据支持以CTCs作为一种液态活检标本来早期检测癌症复发，预后和监测治疗效果。CTCs数目非常稀少，良性疾病患者体内和正常人体内没有，早期肺癌患者体内数目稀少，但在整个癌症发展过程中均可被检测到，在疾病早期，CTCs可被用于预测复发风险，治疗过程中，可作为标志物评估治疗反应和指导治疗方案。从而实现早期诊断，早期治疗，复发检测，实现真正的个体化医疗。

现有医院CTCs检测方法和原理为：主要由免疫磁珠富集纯化、靶向探针标记和荧光定量PCR检测三个步骤组成。

(1)免疫磁珠富集纯化的作用是去除红细胞和绝大多数的白细胞；在获得患者血样后，采用红细胞裂解、离心的方法去除红细胞，然后用免疫磁珠的方式去除绝大多数的白细胞，得到样品中剩余的稀有细胞包括叶酸受体阳性细胞，达到对目标细胞富集的目的。

(2)靶向探针标记使用特异性小分子探针对叶酸受体阳性细胞进行标记，这种特异性小分子探针由识别叶酸受体的化学小分子与寡聚核苷酸偶联形成。在小分子探针与叶酸受体阳性细胞充分结合后，洗涤去除未结合的探针；然后洗脱受体结合的探针，用于后续定量检测。

(3)荧光定量PCR检测利用针对小分子探针设计的特异性引物，结合Taqman探针，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对叶酸受体结合的小分子探针中的寡聚核苷酸进行定量检测；最终依据校准曲线定量检测，评估样品中叶酸受体细胞水平。

存在以下不足之处：以叶酸受体为CTCs标志物，然而部分细胞对叶酸受体的表达水平较低，即叶酸受体作为CTCs标志物，覆盖面不全；使用叶酸和叶酸受体识别对，捕获CTCs，使用磁珠辅助分离，检测过程为非均相，其操作复杂，影响实验结果准确性：使用聚合酶链式反应(PCR)作为信号放大技术，其需要蛋白酶参与，且反应为变温过程，需要成熟仪器；难以实现POCT分析，以及可视化读取：成本较高，单次收费2000-4000元，且仅仅可在大型医院内完成，其覆盖面较窄。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，以解决现有技术中采用叶酸受体作为循环肿瘤细胞的标志物时，由于部分细胞对叶酸受体的表达水平较低，导致覆盖面不全；检测过程非均相，操作复杂，影响实验结果准确性；以及难以实现POCT分析等技术问题。

本发明的目的之二在于提供一种以粘蛋白作为标志物的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法。

为了实现上述目的之一，本发明一实施例提供了一种粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，包括以下步骤：

在MOPS缓冲液中加入HP-DNA，AgNO₃或者Hg²⁺溶液，室温下避光反应，形成具有C-Ag⁺-C结构或者T-Hg²⁺-T结构的A液；