[发明专利]一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法

权利要求书

1.一种生物催化制备 (R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物和低共熔溶剂，以pH7.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于30～35℃、200 rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇；所述辅助底物为异丙醇；所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR；

所述转化体系由催化剂、底物、辅助底物、低共熔溶剂和磷酸缓冲液构成；所述低共熔溶剂组成中的氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1；所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为赖氨酸；

所述催化剂加量以转化体系总体积计为40~60 g/L；所述底物加量以转化体系总体积计为100 mmol/L；所述辅助底物体积加入量以转化体系总体积计为15~20%；所述低共熔溶剂加入量以转化体系总体积计为1~4%；

所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR按如下方法构建：以含雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904源短链脱氢酶的质粒pET28a(+)为模板，经易错PCR、定点突变获得突变体LXCAR，该突变体核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示；将获得的突变体基因与表达质粒pET28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建获得了含雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904短链脱氢酶突变体基因的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a(+)-LXCAR；

SEQ IDNO.3：

atggcgcagt acgacgtggc cggacggtcc gcgatcgtga ccggaggcgg ctcgggcatc 60

gggcgcgcca tcgccctcac cctcgcggcg agcggagcgg ccgtcctcgt caccgacctg 120

aacgaggaaa acgcaaatgc cgtcgtggcg gagatcagcg ccgcgggcgg caccgcgcgg 180

gcactcgccg gcgatgtgac cgacccggcc ttcgccgagg ccagcgtcgc ggccgcgaac 240

gagctggccc cgctgcgcat cgccgtcaac aacgccggca tcggcggagc ggcagcaccg 300

gtcggcgact acccgctcga ctcgtggcgc aaggtcatcg aggtcaacct caacgccgtc 360

ttctacggga tgcaggcgca gctcgacgcg atcggcgcga acggcggcgg cgcgatcgtc 420

aacatggcgt ccatcctggg cagcgtcggc ttcgccaact attcggcgta cgtcaccgcg 480

aagcacgcgc tgctcggcct gacgcagaac gcggcgctgg agtacgccgg caagaacgtc 540

cgtgtcgtcg cggtcggccc cggcttcatc cgcaccccgc tcgtggcgtc gaacatggac 600

gcggacaccc tcgccttcct cgagggcaag cacgcgctcg gccgcctggg cgagccggag 660

gaggtcgcct cgctggtcgc gttcctcgcc tccgacgccg ccagcttcat caccggcagc 720

taccacctgg tcgacggagg ctacacagca caatag 756。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂的制备方法为：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养12 h，再以体积浓度1%的接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.9后，向培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，置于30℃、200 rpm下诱导培养10 h；培养结束后，4℃、10000 rpm离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR湿菌体。