[发明专利]无血清驯化培养间充质干细胞的方法和所用的培养基

权利要求书

1.3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇和硝酸镁的组合在制备用于无血清驯化培养间充质干细胞的驯化培养基中的用途；所述驯化培养基组成为：转铁蛋白10ng/mL、胰岛素10ng/mL、3-(2-甲氧基苯氧基)-1,2-丙二醇0.1mg/mL、硝酸镁以镁离子浓度计5µg/mL、0~9.5%胎牛血清、平衡量的DMEM/F12培养基；无血清驯化培养间充质干细胞包括如下步骤：

(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管，

(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm³的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL，

(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃ 5% CO₂培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化，

(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞，

(5)将P0代细胞沉淀用含小于10%胎牛血清的驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×10⁴个MSC细胞/cm²接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃ 5% CO₂培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞，

(6)采用步骤(5)培养和消化的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的MSC驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞，任选的

(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代。

2.根据权利要求1的用途，其中所述MSC完全培养基是含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1的用途，步骤(3)中，每间隔2-3天补液一次，每次补加3-4mL的MSC完全培养基。

4.根据权利要求1的用途，步骤(4)中，加入胰蛋白酶溶液后，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶充分覆盖细胞表面，消化1min，至显微镜下观察细胞收缩成圆形，轻轻拍打培养瓶，使细胞成流沙状脱落至培养瓶底部。

5.根据权利要求1的用途，步骤(4)中，在离心机中以1400rpm离心5min。

6.根据权利要求1的用途，步骤(5)中，将P0代细胞沉淀用含7~9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬。

7.根据权利要求1的用途，步骤(5)中，将P0代细胞沉淀用含8~9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬。

8.根据权利要求1的用途，步骤(5)中，将P0代细胞沉淀用含8%、8.5%、9%、或9.5%胎牛血清的MSC驯化培养基重悬。

9.根据权利要求1的用途，步骤(6)之重复步骤(5)的过程中，随着细胞代次的增加，MSC驯化培养基中的胎牛血清浓度降低，直至胎牛血清在MSC驯化培养基中的浓度为0。

10.根据权利要求1的用途，步骤(6)中，通过逐渐降低胎牛血清浓度的方式，至P4~P10代得到无血清体外驯化培养的间充质干细胞。

11.根据权利要求1的用途，步骤(7)中，对步骤(6)最终所得0%胎血清体外驯化培养的间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代，继续传至无血清驯化培养的P20代间充质干细胞。