[发明专利]非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建。本发明首先发现了非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN‑β的激活，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN‑β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；其次本发明发现了非洲猪瘟病毒E120R蛋白的免疫抑制位点，并通过基因工程手段构建获得了E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著增强，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒E120R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁。

非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。非洲猪瘟病毒具有20面体结构，直径为175-215nm，基因组全长170-190kb，含有151个开放阅读框，可编码150-200种蛋白，可以编码的结构蛋白有54种以上，包括p54、p72、p30等，具有复杂的免疫逃逸机制。其中p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25ku，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网处，P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网转化成病毒包膜前体时起十分重要的作用。p72是主要的结构蛋白之一，根据p72基因末端一段478bp的核酸序列，非洲猪瘟可分为23个基因型，如Benin97/1为基因I型，Ma lawi Li20/1为基因VIII型，东非埃塞尔比亚分离株属于基因XXIII型。非洲猪瘟病毒基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性。非洲猪瘟病毒不能够诱导产生中和抗体，因此还没有对血清型进行分类。

E120R蛋白也属于ASFV的结构蛋白，其具有与DNA结合的活性，且在病毒质膜运输中发挥着重要作用。本发明首先意外发现，非洲猪瘟病毒E120R蛋白能够抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β的激活，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG56和ISG15的mRNA表达，抑制cGAS/STING和poly(dA:dT)诱导的IRF3的磷酸化，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。

基于上述发现，本发明通过突变PCR、基因合成等方法构建了一系列E120R蛋白突变体质粒，筛选出了发挥免疫抑制功能的关键位点；并通过在非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中缺失了E120R蛋白的免疫抑制位点，构建获得了一种E120R蛋白的免疫抑制位点敲除的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

发明内容