[发明专利]一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种球形孢子丝菌Gp70(Glycoprotein 70)重组蛋白的制备方法及其应用，通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌糖蛋白70(Gp70)基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。本案构建了球形孢子丝菌Gp70重组蛋白原核表达体系，通过诱导可以快速大量表达；利用Ni亲和层析柱一步完成纯化，纯化过程简单快捷；免疫动物制备高效价多克隆抗体，所制备的抗体与目的蛋白具有良好的反应特异性。

技术领域

本发明涉及重组蛋白制备领域。更具体地说，本发明涉及一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相型暗色真菌申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii sensu lato，下文简称Ss.)感染引起的最常见的深部真菌病。Ss.在环境中为菌丝相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染机体后，病灶中为酵母相。Ss.感染可形成难以自愈的慢性感染，不仅累及皮肤，也可通过淋巴管途径感染脏器，发生播散的、系统的致命性感染。我国东北三省是该病全球流行最为严重的地区之一。

早期人们认为申克孢子丝菌为单一物种，但随着研究的深入，Marimon等将Ss.确定为6个种的复合体，包括狭义申克孢子丝菌(S.schenckii sensu stricto)、球形孢子丝菌(S.globosa)、巴西孢子丝菌(S.brasilienis)、卢艾里孢子丝菌(S.luriei,formlynamed S.var.luriei)、墨西哥孢子丝菌(S.mexicana)和苍白球孢子丝菌(S.pallida,synonymy S.albicans)，其中，球形孢子丝菌(呈全球性分布)、申克孢子丝菌(主要分布于美国、阿根廷、巴西、秘鲁等美洲国家)和巴西孢子丝菌(主要分布于巴西地区)为常见致病菌。对于我国流行的菌株，绝大多数基因分型研究发现基本上均为球形孢子丝菌。

目前该病的诊断主要依靠皮肤组织病理检查和真菌培养的联合应用。病理检查需经过标本固定、包埋、制片、染色等数个耗时步骤，患者需等待5-7天，方可得到结果，然而如病理切片并未显示星状体、阳性孢子等典型的病理改变，尚无法诊断该病，则需联合真菌培养进行诊断。真菌培养同样需以病变组织为样品，而培养结果需等待7-14天，耗时更长，同时真菌生长受环境影响程度较大，当环境温度、湿度等各方面不适宜时，则不易生长，因此阳性率无法达到我们所需求的理想程度。另外，上述两种方法均为有创检查，术后伤口愈合会遗留疤痕，对于儿童患者及面部感染患者并非理想的检测手段。如上所述，真菌培养和病理诊断均耗时较长，并且医疗机构需具备较高的实验条件和专业的技术人员，在基层医院无法开展，只能凭借医生的临床经验予以治疗。目前的研究表明，孢子丝菌感染人体或动物后，其抗原可刺激机体产生抗体，此种抗原-抗体反应可作为开发体外诊断试剂的依据。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用。本发明旨在通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌糖蛋白70(Gp70)基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

S1：人工合成球形孢子丝菌Gp70基因序列，并在其中引入Nde I酶切位点、HindIII酶切位点、His标签和终止子；

S2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；