[发明专利]一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：人工合成球形孢子丝菌Gp70基因序列，并在其中引入Nde I酶切位点、Hind III酶切位点、His标签和终止子；

S2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；

S3：将球形孢子丝菌Gp70基因序列与pET-30a质粒进行连接反应，构建出表达质粒；

S4：对所述表达质粒进行扩增；

S5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；

S6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌Gp70重组蛋白；

S2中对人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证的方法为：

以pUC57质粒为载体，制得重组质粒pUC57/Gp70；

于含有Amp的LB培养基的琼脂平板挑取含质粒pUC57/Gp70的DH5α单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，在37℃下200 rpm培养过夜；按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒；加入pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀；紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度；对获得的质粒进行双酶切，双酶切体系如下：

30℃ 酶切3 h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用全式金凝胶回收试剂盒回收DNA片段；

根据球形孢子丝菌Gp70基因序列设计引物，上游引物为5’-CATATGGCTATATACGTAGCATCAAAC-3’；下游引物为5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；对DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列是否为预期序列；

所述球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的序列为：

MAIYVASNTANNAVVAVPIAENGSLLVAKGSSTATGGAGANGVSGGAPAGPDSLFSQSGVAIAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDKHNPAKLTVVGKSASLPGEFPTTVAASDKYKLVCVGLTGAKAGVACASYSAAGIGAVDALRPFNLGQTTPPAGPLNTVSQVFFSEDETTLYVTVKGDPTVSNTGFLAAFPVQNTRSSCHAAASVAASGVTSSPSGTAVLFGSSTIKGSSNLFVTDASFGAAVLSVDASGKASTVGKGVIAGQAATCWVAISPATKTAFVTDVGIDRLVEMSLEDASIIGSPIDLSASNGGVDPGLTDLRAAGSFVYALSPGNGTSDAAITVFNALTKQAVDHVSVASLGLTKSVEGMAILLHHHHHH。

2.如权利要求1所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，S3中连接反应具体为：

pET-30a质粒经Nde I和Hind III双酶切回收载体片段，随后与球形孢子丝菌Gp70基因序列进行连接反应，条件如下：

加水至终体积为25 u1，混匀，16℃反应过夜，反应结束加入乙酸钠、冷无水乙醇，-20℃放置60min；离心收集沉淀，用70%的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE缓冲液溶解，得到表达质粒。

3.如权利要求1所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，S4中，对所述表达质粒进行扩增，具体为：

从37℃培养20h的LB平板中挑取大肠杆菌E.coli DH5α单个菌落，转入烧瓶中，于37℃，220rpm，震荡培养3 h；

随后转至用冰预冷的离心管中，置于冰上直至培养物冷却到0℃；

4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；

以冰预冷的CaCl₂重悬沉淀，置于冰上；取上述细胞，加入S3得到的表达质粒，轻搅混匀，冰浴30 min；42℃水浴90 s，置冰浴上1 min；加入LB液体培养基，37℃，200 rpm振荡培养45min；取培养液涂布于含100 μg/mL青霉素的LB固体培养基，37℃培养；

挑取单个菌落接种于含100 μg/mL青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡过夜；提取质粒进行双酶切鉴定，得到重组质粒。