[发明专利]一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法

说明书

本发明提供了一种检测水产品中呈味肽L‑γ‑谷氨酰‑L‑缬氨酰‑甘氨酸的方法，涉及食品检测技术领域。本发明采用2,4‑二硝基氯苯为衍生试剂，γ‑Glu‑Val‑Gly与2,4‑二硝基氯苯之间发生亲核芳香取代反应，亲核阴离子由γ‑Glu‑Val‑Gly碱基电离生成，它攻击2,4‑二硝基氯苯中含氯原子的碳，使氯离子离开从而生成衍生产物。本发明采用的2,4‑二硝基氯苯衍生试剂不仅稳定性好，而且价格低廉，以所述衍生试剂进行呈味肽L‑γ‑谷氨酰‑L‑缬氨酰‑甘氨酸的检测，具有准确度高、灵敏度高、成本低的优点，可以满足水产品中呈味多肽L‑γ‑谷氨酰‑L‑缬氨酰‑甘氨酸的定性、定量检测需求，并且操作简便。

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法。

背景技术

γ-谷氨酰肽是指含有γ-谷氨酰残基的一类小分子肽，是由谷氨酸或者谷氨酰胺的γ-羧基基团与氨基酸或多肽的氨基基团发生脱水缩合形成的，近年来，因其具有显著的呈味效果而被广泛关注。γ-谷氨酰肽作为kokumi风味(又称浓厚味)的主要贡献者，赋予食物特有的浓厚感、持续性、饱满感和丰富度，并且会提升五种基本口味的协调性以及咸味、鲜味和甜味的呈味强度。L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸(γ-Glu-Val-Gly)是γ-谷氨酰肽中呈味强度最高的物质，研究表明，其味感受活性是谷胱甘肽的12.8倍。Kuroda团队陆续在商业鱼露、酱油、虾酱、酿造酒精饮料、扇贝及加工扇贝等食品中检测鉴定获得γ-Glu-Val-Gly，Sofyanovich等也在酵母提取物中分离获得该三肽物质。

目前关于γ-Glu-Val-Gly的测定方法主要有高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法。食品安全标准与监测评估司发布的《关于弯曲乳杆菌等24种“三新食品”的公告(2019年第2号)》中确定了适用于通过化学合成制得的食品添加剂γ-Glu-Val-Gly的测定方法。该方法以高效液相色谱进行检测，采用ODS-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱和紫外检测器，根据国家标准GB/T27579-2011《精油高效液相色谱分析通用法》中9.0内标法进行定量。但该方法灵敏度不高，不能完全满足痕量或超痕量检测。已有文献关于γ-Glu-Val-Gly的检测多采用LC-MS/MS法，即以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)作为柱前衍生试剂，通过反相高效液相色谱对样品进行分离，利用MS/MS进行结构鉴定，质谱检测采用电喷雾离子源正离子扫描模式，多反应监测(MRM)模式下对碎片化的目标物进行特定质荷比扫描，以内标法进行定量分析。但该方法的缺陷在于其专用AQC衍生试剂盒价格昂贵，并且AQC衍生试剂易与环境中的潮气反应，稳定性差，保存和使用过程中易被污染失效；另外，据Kuroda团队文献报道，以AQC为衍生化试剂获得的样品中γ-Glu-Val-Gly衍生物色谱图复杂(图7)，衍生化副产物对目标物的定性定量分析产生干扰。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法，本发明以稳定性好且价格低廉的2,4-二硝基氯苯为衍生剂进行呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的检测，具有准确度高、灵敏度高、成本低的优点；且多反应监测模式下获得目标物定性、定量离子色谱图简单，无衍生副产物的干扰。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)提供待测水产品提取液，将所述待测水产品提取液与内标物溶液和去离子水混合，得到待测混合液；

(2)将所述待测混合液与缓冲溶液、2,4-二硝基氯苯溶液混合进行涡旋，得到待测涡旋液；将所述待测涡旋液在50～90℃条件下避光进行衍生化反应，得到待测进样液；

(3)将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到γ-Glu-Val-Gly色谱图和内标物色谱图；