[发明专利]一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法

权利要求书

1.一种检测水产品中呈味肽L-γ-谷氨酰-L-缬氨酰-甘氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供待测水产品提取液，将所述待测水产品提取液与内标物溶液和去离子水混合，得到待测混合液；

(2)将所述待测混合液与缓冲溶液、2,4-二硝基氯苯溶液混合进行涡旋，得到待测涡旋液；将所述待测涡旋液在50～90℃条件下避光进行衍生化反应，得到待测进样液；所述2,4-二硝基氯苯溶液为2,4-二硝基氯苯的乙腈溶液；所述2,4-二硝基氯苯溶液的质量浓度为5～20％；所述2,4-二硝基氯苯溶液与待测混合液的体积比为1:1～1:3；

(3)将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到γ-Glu-Val-Gly色谱图和内标物色谱图；

所述液相色谱-串联质谱检测中液相色谱条件包括：

C18色谱柱：粒径3μm，尺寸规格2.1mm ID×100mm；柱温：35℃；

流动相：A相为25mM甲酸水溶液，pH值为6.0；B相为60％体积分数的乙腈水溶液；流动相梯度洗脱程序：0～6min，B相体积分数35％；6.1～12min，B相体积分数100％；12.1～20min，B相体积分数35％；

进样量：2.0μL；流速：0.2mL/min；

所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件包括：

电喷雾离子源为正离子扫描模式；

离子源参数：雾化气温度350℃，雾化气流速为12L/min，雾化器压力为20psi，毛细管电压为4.0kV；

一级质谱数据采集采用全扫描模式，扫描范围为m/z 50～500；二级质谱数据采集采用多反应监测模式；

γ-Glu-Val-Gly的定性离子对为470.1/395、470.1/367和470.1/184.2、定量离子对为470.1/72.2，内标物定量离子对为345.0/71.1；

(4)将由所述γ-Glu-Val-Gly色谱图和内标物色谱图得到的γ-Glu-Val-Gly和内标物的峰面积之比代入标准曲线，计算得到水产品中γ-Glu-Val-Gly的含量；所述标准曲线为γ-Glu-Val-Gly标准品和内标物的峰面积之比与γ-Glu-Val-Gly标准品溶液浓度之间的线性曲线。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中提供待测水产品提取液的方法包括：

将待测水产品的可食部位剪碎后进行研磨，得到匀浆样品；

将所述匀浆样品与去离子水混合，将所得混合料液依次进行均质、搅拌和离心，得到上清液；

将所述上清液经0.45μm滤膜过滤，再将滤液进行超滤离心，所得下层滤液为所述待测水产品提取液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述匀浆样品与去离子水的用量比为10g：100mL；所述均质和搅拌均在冰浴条件下进行；所述均质的速度为9000rpm，时间为3min；所述搅拌的速度为300rpm，时间为20min；

所述离心和超滤离心的温度为4℃，离心力为5000g，离心和超滤离心的时间独立为10～15min；所述超滤离心的滤膜截留分子量为10KD。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的内标物为L-精氨酸-¹⁵N₄；所述内标物溶液的浓度为0.2mg/L；所述待测水产品提取液、内标物溶液与去离子水的体积比为1:1～2：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的缓冲溶液为Na₂CO₃-NaHCO₃溶液，所述缓冲溶液的pH值为9.0；所述缓冲溶液与待测混合液的体积比为1:1～2:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中衍生化反应的时间为60～100min；所述衍生化反应后加入乙酸终止反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述衍生化反应终止后，还包括将所得反应液与水混合定容，然后经0.45μm滤膜过滤，滤液为所述待测进样液。