[发明专利]一种评价保健品增强免疫力功效的方法

说明书

本发明属于检测技术领域。本发明公开了一种评价保健品增强免疫力功效的方法，其包括采用斑马鱼设置模型对照组和供试品组、荧光拍照并分析斑马鱼尾部巨噬细胞荧光强度S及利用荧光强度S计算增强免疫力作用。本发明不用进行试剂的浓度摸索，采用的试剂都较为稳定可以减少实验步骤；斑马鱼增强免疫力模型实验周期相对于小鼠实验更短，仅需24小时；由于斑马鱼饲养成本低、体积小、发育周期短、单次产卵数量高的特点能同时进行多个样品的评价；以斑马鱼尾部巨噬细胞荧光强度总和S为判断标准，只要供试品组斑马鱼与模型对照组比有显著性差异即可判断为具有增强免疫力的作用；用到的诱导剂长春瑞滨是一种常见的化疗药，毒性作用较小。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其是涉及一种评价保健品增强免疫力功效的方法。

背景技术

目前评价增强免疫力功能检测方法一般采用哺乳动物模型(小鼠)，采用近交系小鼠，单一性别，18-22g，每组10-15只，以人体推荐的10倍为其中一个剂量组，另设二个剂量组。受试样本给予时间为30天，必要时可延长至45天。测试项目为：体重、脏器/体重比值测定、细胞免疫功能测定、体液免疫功能测定、单核-巨噬细胞功能测定、NK细胞活性测定。

一、脏器/体重比值测定：实验终末，称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏，电子分析天平上称重，计算脏/体比值。

二、细胞免疫功能测定：

1)ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验：

①MTT法：实验需先配置试剂包括完全培养液、ConA液、无菌Hank’s液、MTT液、酸性异丙醇溶液；随后配置脾细胞悬浊液：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，将细胞悬浮于1mL完全培养液并调整细胞浓度为3×10⁶个/mL；再进行淋巴细胞增殖反应：将每份脾细胞悬浊液分两孔加入24孔培养板，一孔加75μLConA液，另一孔作为对照，置于37℃5％的CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打使紫色晶体完全溶解，随后分装到96孔板，每个孔作3个平行孔，用酶标仪在570nm波长测定光密度值。

②同位素掺入法：无菌取脾，置于无菌Hank’s液平皿中制成单个细胞悬液，用筛网过滤，Hank’s液洗涤并离心，将细胞悬浮于2mL完全培养液，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL；再进行淋巴细胞增殖反应：将每份脾细胞悬浊液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加ConA(5μg/mL)，另3个孔不加ConA作为对照，置于37℃5％的CO₂孵箱中培养72h。培养结束前6h，每孔加入³H-TdR 20μL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

2)迟发型变态反应(DTH)：

①二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)：先配置新鲜DNFB溶液，再将小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛约3cm×3cm，用DNFB均匀涂抹致敏，5天后，再用DNFB均匀涂抹小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击24h后颈椎脱臼处死小鼠，减下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

②绵阳红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)：小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔注射或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL，免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL。注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。

三、体液免疫功能测定：

1)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：