[发明专利]人测序样品追踪标记物、人测序样品交叉污染的监控方法及监控装置

说明书

本发明公开了一种人测序样品追踪标记物、人测序样品交叉污染的监控方法及监控装置。其中，该标记物的序列来源于詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii，且与人类参考基因组序列比对结果无匹配。本发明的人测序样品追踪标记物序列来源于詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii，且与人类参考基因组序列比对结果无匹配，因此可以更好的起到追踪标记的作用。进一步的，本发明通过追踪标记物和交叉污染模型两方面的双质控体系，最大限度地在增加少量成本和操作基础上，能够灵敏的检测样本是否发生颠倒交换和交叉污染，对样本进行识别和质控，保证测序数据的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种人测序样品追踪标记物、人测序样品交叉污染的监控方法及监控装置。

背景技术

二代测序技术(NGS)在双脱氧链终止法(Sanger法)测序的基础上，实现了多通道同时对多个核酸分子进行测序，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展，在分子生物学、临床医学、疾病筛查与检测等方面有着重要应用，为分子水平上的致病基因研究提供了强有力的平台。但同时，二代测序技术需要同时处理大量样本，统一进行标准化文库构建操作，这个过程中不可避免的增加了样本颠倒交换和交叉污染的风险。尽管美国临床病理学会(CAP)发布了防止样本污染的相关文件，并且许多实验室选择对测序结果通过Sanger测序进行二次验证，但仍无法有效解决临床试验样本测序中出现样本污染的问题。

尽管测序过程中出现的样本污染概率有限，且污染物所占比例不高，但医疗数据和样本身份的任何混淆都会对基因研究结果产生巨大影响。有证据表明，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增的高通量测序过程中，当测序深度足够时，非常低水平的核酸污染也能够在测序数据中显示出来，在很多临床研究中，即使是非常低水平的污染也会导致研究结论不准确，甚至在临床环境下可能导致患者疾病报告结果出现偏差。例如在对比肿瘤和正常癌症的研究中，很小的污染水平也会导致敏感性降低，从而出现许多假阳性。

因此，除了在样本处理时减少人为操作失误以及增加实验室自动化设施减少样本污染以外，一种可以在测序数据下机后对样本来源进行追踪和判别的质控系统显得尤为重要。

有数据表明，经过系统发育关系的分析后发现，在序列数据库条目中可能存在高达5％的错误，但无法确定该错误的发生原因。因此目前已经采取了各种手段对样本进行质控和监测，以期能够有效控制样本间颠倒交换以及样本间交叉污染问题。

这些手段按照原理主要分为两类，一种是通过生物信息学比对样本信息，以此确定该样本中是否含有其他样本的生物学信息，这种方法能够应对一部分样本的交叉污染问题。在千基因组计划中，通过将序列变异与相应样本的人类基因组单体型图(Haplotypemap图谱)数据库信息进行比较来验证样本身份，并编写生物信息学工具来评估交叉污染水平。单核苷酸多态性(SNPs)在人类样本中是一种独特的生物标签，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。利用SNPs位点分析，可以有效区分样本中混有的其他人类样本，并以此为依据开发出新的算法软件。

另一种方法是通过对原始样本进行标记，使该标记能够跟随原始样本整个测序过程一起流转，根据测序数据中检测到的标记信息来确定原始样本，该方法能够在一定程度上应对样本的颠倒交换问题。例如，利用一种独特的附着在引物的5′端寡聚物来标记样本，测试中使用了894个独特的寡核苷酸连接到三对引物(用于扩增三个片段)的5′端以标记894个样本。可以通过调整寡核苷酸长度来标记任意数量的样本。另外，还有通过添加三个独特的大小不等的插入片段标记扩增子的混合物，在测序结束后对固定序列进行检测来监测样品混合和交叉污染情况以及设计大小约200bp的控制序列并将其构建到载体上，接受样品之初进行添加并跟随测序过程流转以达到监控目的等等。