[发明专利]一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法

说明书

本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法，优选硫堇‑亚硫酸盐染色，易溶于热水，并有显著的因光异色作用，最大吸收波长(水中)602.5nm，适用于高特异性细胞核DNA定量染色，弥补了Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)共染带来的背景杂乱，特异性不高的缺点。本发明适用于各类细胞核DNA染色，尤其适用于细胞DNA定量染色分析；可与其余多种细胞质/蛋白染色方法联用，适用性广，商业用途价值高。

技术领域

本发明涉及一种细胞DNA定量检测的染色方法，尤其涉及一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)染色方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法、吖啶橙荧光法等，其中最经典的是Feulgen法，Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。该法是一种经典的酶组织化学法。Leagene Feulgen stain原理在于：DNA经弱酸(1mol/LHCl)水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff(无色品红亚硫酸溶液)试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基(醌基是一个具有颜色的发色团)，所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量或倍体成正比。

细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA进行特异性染色、仪器测定细胞核内DNA含量或倍体来判断细胞的生理状态和病理改变。DNA定量细胞学在宫颈癌、口腔鳞癌、头颈部肿瘤、颈部淋巴结肿大、乳腺癌、胃癌、肺癌、泌尿系肿瘤、胸腹积液的临床应用及研究中有重大意义。

因传统方法中由载玻片承载的组织、细胞经酸解、固定、水洗等操作后，极易出现不同程度的载玻片掉片(即组织、细胞等标本从载玻片上部分或全部脱落缺失的现象)，造成假阴性的情况，直接影响结果的判定甚至降低方法学的准确性。为此，科研人员研发了各类防脱载玻片，例如CN201921220040.1、CN201521113399.0等所设计的防脱载玻片通过提高洁净度、增加黏附层、增设卡槽等手段对液基细胞学、组织染色等出现的掉片现象有大幅改善。

然而，由于传统方法染色过程繁琐，极易受组织固定液种类、酸解时间和温度的影响，仅仅通过增强黏附力防止掉片是治标不治本的，防脱载玻片的脱片仍时有发生。方法学中冷、热、酸、碱、醇对于防脱载玻片的影响仍未得到根本解决。因碱性Schiff特异性不高，背景易出现共染现象，影响结果的判定，降低准确性。

发明内容

针对上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色液，包括：

试剂A，包括：硫堇、染色助剂和水；

试剂B，选自甲醇、叔丁醇、乙醇、乙二醇、盐酸、磷酸中的一种或多种；

试剂C，包括：亚硫酸盐和超纯水；

所述试剂A、试剂B和试剂C的体积比为：5：1：4(V/V/V)。

硫堇，带黑绿色闪光针状结晶。易溶于热水，开始是蓝色，后呈紫色，并有显著的因光异色作用。溶于氯仿，微溶于乙醇、乙醚和冷水。最大吸收波长(水中)602.5nm。也是染色剂，如细胞核的染色，类淀粉蛋白、嗜碱性细胞和黏蛋白染色，活体染色。替代Feulgen染色的碱性品红，特异性更高(背景不易出现共染现象)。