[发明专利]一种抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法，使用免疫法制备特异性识别血浆蛋白的CXCR1的单克隆抗体。使用本发明的抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法，成功的生产了高活性、高质量的CXCR1的抗体，且本发明的制备方法简单、高效、成本低。

技术领域

本发明具体涉及一种抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法。

背景技术

CXCR1蛋白是一种A类视紫红质样G蛋白偶联受体，它能够与炎症信号白介素8结合，并通过细胞内的G蛋白触发一系列级联事件，动员免疫细胞。人类的CXCR1基因定位于2q35，包含两个外显子和一个1.7kb的内含子，CXCR1 cDNA是由一个ORF编码350个氨基酸的蛋白，包含1个糖基化的N端和一个具有7次跨膜区域的g蛋白偶联受体。主要表达在T细胞，单核细胞，单核样细胞，黑色素瘤细胞表面，可与CXC趋化因子NAP-2、ENA-78、GRO等特异结合可趋化表达CXCR1的中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等细胞的游走、脱颗粒等一系列生物学效应，在机体的抗感染、抗病毒免疫中发挥重要的作用。

目前，对该类的膜蛋白抗体的产生，却存在着很大的困难，因为天然跨膜蛋白难以获得，原核表达的蛋白不具有糖基化的修饰，免疫出的抗体往往不能很好的识别细胞中的CXCR1蛋白。跨膜蛋白因蛋白质会留在细胞的表面而导致难以通过常规的方式来获得，并且产生糖基化抗体的生产通常只能通过真核系统的表达来获得，所以想通过富集和纯化糖基化后的膜蛋白作为抗原不仅难度大，也很难大量获得且获得含量很低。而且更重要的是，经过一系列的纯化过程可能会对糖基化后的膜蛋白造成影响，CXCR1属于膜蛋白，表达的蛋白很难分泌到胞外，获得蛋白抗原几乎不可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供一种抗人CXCR1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的CXCR1的单克隆抗体。

优选地，其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫使用弗氏完全佐剂对小鼠进行免疫加强。

进一步优选地，所述外源基因为C端融合有GFP基因的人CXCR1基因。

更为优选地，所述的人CXCR1基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

更为优选地，所述的人CXCR1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述的带有外源目的基因的稳定细胞株通过将所述外源基因瞬时转染CHO细胞制得。

进一步优选地，所述瞬时转染为电击转染，转染条件为电压150～170V，电击时间为20～30ms，电压为方形波电压。

进一步优选地，在所述瞬时转染46～52小时后进行小鼠免疫。

本发明第二方面提供一种所述的制备方法制得的能够特异性识别血浆蛋白的CXCR1的单克隆抗体在试剂盒中的应用。

本发明中，使用的CHO细胞为上皮贴壁型细胞，具有不死性，可以传代百代以上。另外，CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，哺乳动物细胞表达可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的理想宿主。

本发明对标签蛋白绿色荧光蛋白GFP的引入同时考虑到三个方面的因素：1.由于GFP基因是融合在CXCR1基因的C端，并不会对蛋白的分泌有所影响。2.在整个转染、感染和筛选的过程中，在荧光显微镜下可以直接观测到绿的荧光，可以免除了细胞裂解后进行的表达确认检测。3.作为一种载体蛋白，GFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫，类似于多肽交联于BSA蛋白产生的作用。