[发明专利]一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种抗人KL‑6蛋白单克隆抗体的制备方法，使用免疫法制备特异性识别血浆蛋白的KL‑6的单克隆抗体。使用本发明的抗人KL‑6蛋白单克隆抗体的制备方法，成功的生产了高活性、高质量的KL‑6蛋白抗体，且本发明的制备方法简单、高效、成本低。

技术领域

本发明具体涉及一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。

背景技术

KL-6对判断Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。若肺部基底膜的损害，可致血管通透性增加，使KL-6入血。血清中KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。KL-6水平能敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度。近年的多项研究报道了KL-6高水平表达可能与间质性肺疾病、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联,其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙,从而影响纤维化的发生和发展。

目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对血浆中的这些糖蛋白抗体的产生，传统的方法往往存在一定的不足，因为具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原一般都不强，原核表达的蛋白不具有糖基化的修饰，免疫出的抗体往往不能很好的识别血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这样不仅工序复杂，而且所需要的血清很难大量获得且含量很低，这对于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，经过一系列的纯化过程可能会对糖蛋白造成影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体。

优选地，其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫，待效价≥20000后，将多肽与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫加强。

进一步优选地，所述外源基因为C端融合有GFP基因的人KL-6基因。

更为优选地，所述的人KL-6基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

更为优选地，所述的人KL-6基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述的带有外源目的基因的稳定细胞株通过将所述外源基因瞬时转染CHO细胞制得。

进一步优选地，所述瞬时转染为电击转染，转染条件为电压150～170V,时间20～30ms，电压为方形波电压。

进一步优选地，在所述瞬时转染46～52小时后进行小鼠免疫。

本发明第二方面提供一种所述的制备方法制得的能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体在试剂盒中的应用。

本发明中，使用的CHO细胞为上皮贴壁型细胞，具有不死性，可以传代百代以上。另外，CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，哺乳动物细胞表达可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的理想宿主。

本发明对标签蛋白绿色荧光蛋白GFP的引入同时考虑到三个方面的因素：1.由于GFP基因是融合在KL-6基因的C端，并不会对蛋白的分泌有所影响。2.在整个转染、感染和筛选的过程中，在荧光显微镜下可以直接观测到绿的荧光，可以免除了细胞裂解后进行的表达确认检测。3.作为一种载体蛋白，GFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫，类似于多肽交联于BSA蛋白产生的作用。