[发明专利]一种有效的免疫印迹的PVDF膜标记方法、一抗孵育方法及洗脱、显色方法

说明书

本发明公开了一种有效的免疫印迹PVDF膜的标记方法和一抗孵育方法，属于蛋白免疫印迹检测领域。本发明的免疫印迹PVDF膜的标记方法，是用无墨中性笔隔着不透水薄膜对PVDF膜进行标记。本发明的一抗孵育方法，是在将PVDF膜和一抗溶液共同置于BD管中，再将BD管置于Crystal试管旋转混匀器，保持试管旋转12‑16h，期间的环境温度为4℃。本发明的洗脱、显色方法，是保持PVDF膜的样品面朝上，进行洗脱、显色。本发明的方法均十分利于提高蛋白免疫印迹的检测能力和结果的可读性。

技术领域

本发明属于蛋白免疫印迹检测领域。

背景技术

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，主要包括如下步骤：1)蛋白样品凝胶电泳；2)转膜：通过电流将凝胶内的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上；3)洗脱：洗去未结合的蛋白；4)封闭：将未结合蛋白的PVDF膜位点结合封闭剂(例如牛乳蛋白)，阻止后续步骤一抗非特异性结合PVDF膜；5)洗脱：洗去未结合封闭剂；6)一抗孵育：将目标蛋白特异性抗体(即一抗)结合到膜上的蛋白；7)洗脱：洗去未结合一抗；8)二抗孵育：将靶向前述一抗的抗体(即二抗)结合到一抗上，二抗上结合有化学发光或酶标记物；9)洗脱：洗去未结合二抗；10)显色：加入发光底物，与二抗上的标记物反应，产生光学信号。在免疫印迹实验中，特别是需要同时进行多个目的蛋白检测时，一般需要在转膜前和/或转膜后对PVDF膜进行标记，以往通过对膜进行不同剪切而达到标记效果，但标记信息受限，不易区分。由于PVDF膜的高疏水性，使用前需要在乙醇等有机溶液中浸泡达活化后使用，之后在转膜、孵育、洗脱、显色等过程中需要多种无机溶剂洗涤，因此很难选择含合适溶剂的笔进行标记。日常生活中常用的中性笔墨水的成分是有机溶剂，如醇类、有机醚类。而圆珠笔油墨中所用染料为油溶性染料和醇溶性染料，标记方式欲充分排除墨水的污染和有效避免有机溶剂、无机溶剂的洗涤较难。日常生活中使用的铅笔也很难作为标记笔，笔尖太细易划破膜，笔尖太粗不易标记。

目前缺少一种行之有效的PVDF膜的标记方法。

另外，作为免疫印迹的关键步骤之一，抗体孵育方式至关重要，特别是一抗的孵育。低温(2-8℃，通常为4℃，下同)过夜孵育和37℃1-2h孵育是一抗孵育的常见方式，其中低温过夜孵育在大多数时候效果更佳。静置的孵育往往不够充分和均匀，影响结果的准确性；而经摇床缓慢摇动可达到充分孵育效果，但由于目前摇床普遍体积大，在冰箱中不宜放置。

目前缺少一种可在冰箱内进行的非静置的一抗孵育方法。

目前免疫印迹中还缺少对洗脱、显色的规范化要求，洗脱、显色效率高低不一。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种有效的免疫印迹PVDF膜的标记方法和一抗孵育方法和洗脱、显色方法。

本发明的技术方案如下：

一种PVDF膜的标记方法，它是手持无墨中性笔隔着不透水薄膜对PVDF膜进行书写标记。

如前述的方法，所述不透水薄膜使PE薄膜。

如前述的方法，所述PE薄膜是PE手套。

一种一抗孵育方法，它是在将PVDF膜和一抗溶液共同置于BD管中，再将BD管置于Crystal试管旋转混匀器，保持试管旋转12-16h，期间的环境温度为4℃。

如前述的方法，所述环境温度为4℃孵育12-16h。

一种免疫印迹的洗脱方法，保持PVDF膜的样品面朝上，浸泡于TBS/TBST缓冲液中，摇床摇晃洗脱。

术语“样品面”，即载有蛋白样品的一面，即转膜时直接接触PAGE胶的面。