[发明专利]一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，包括EnGAM22重组蛋白的制备、动物免疫、杂交瘤细胞的制备和单克隆抗体的制备，EnGAM22重组蛋白免疫小鼠后可产生高效价抗体，制备的杂交瘤细胞株可稳定分泌高性能抗EnGAM22蛋白单克隆抗体。本发明还公开了一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体，亚型分别为IgG2a、IgG2b，结合能力强、特异性好、效价高。本发明还公开了EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球虫虫体中的定位，特异性强，准确性好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒害艾美耳球虫配子体 EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

鸡球虫病(Coccidiosis)是集约化鸡场最常见的禽病之一，给养鸡业造成巨大的经济损失。毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是鸡球虫病的主要病原之一，寄生于鸡的小肠中段，引起鸡的急性小肠球虫病，主要危害8～18周龄的青年鸡。近年来随着鸡球虫病活疫苗的推广应用，以及黄羽鸡饲养周期相对较长且常采用地面放养或圈养，使得毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。因此，迫切需要对该球虫的生物学与分子生物学进行深入研究，发现药物或免疫治疗靶点、或疫苗候选抗原。

卵囊是球虫类寄生虫在宿主间传播的重要发育阶段，是由球虫在配子生殖时受精后的大配子发育而成，其囊壁是由位于球虫大配子体成壁体中的蛋白形成，但配子体蛋白形成卵囊壁的分子机制尚不清楚。单克隆抗体具有很高的特异性和灵敏性，与免疫荧光、免疫电镜等技术结合可将目的抗原定位在虫体，是研究寄生虫虫体细微结构和发育分子机制的重要检测试剂，对于寄生虫病的免疫治疗与机理研究也具有重大意义。迄今，有关毒害艾美耳球虫卵囊壁蛋白单克隆抗体的研制与应用尚未见有报道。为此，本专利制备的抗毒害艾美耳球虫配子体蛋白的单抗，可用于研究球虫卵囊壁形成的分子机制以及配子体蛋白的功能，解析球虫配子体蛋白亚单位疫苗的免疫保护机制等。

发明内容

为了克服现有技术不足，本发明目的之一在于提供一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，本方法用纯化后的高浓度蛋白与一种新型的佐剂混合免疫小鼠可以产生高效价的抗体，制备的杂交瘤细胞株可持续分泌高性能的抗EnGAM22蛋白单克隆抗体。

本发明目的之二在于提供一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体，由上述方法制备，亚型分别为IgG2a、IgG2b，抗体的特异性好，效价高。

本发明目的之三在于提供一种上述单克隆抗体鉴定EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球虫虫体表达情况的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

将重组菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培养基中诱导培养，超声破碎菌体后将上清用Ni-NTA亲和纯化层析柱纯化并透析复性得到 EnGAM22重组蛋白；

采用EnGAM22重组蛋白注射小鼠体内进行免疫，选择血清抗体效价达到评价标准的小鼠作为免疫小鼠；

对所述免疫小鼠注射不加佐剂的EnGAM22重组蛋白，取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行多次亚克隆，最终得到能稳定分泌特异性抗EnGAM22蛋白抗体的杂交瘤细胞；

对BALB/c雌性小鼠注射腹水专用佐剂，腹腔注射杂交瘤细胞，抽取腹水并纯化得到抗EnGAM22蛋白单克隆抗体。

一种抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：