[发明专利]一种小鼠单倍体干细胞的获得方法

说明书

本发明公开了一种小鼠单倍体干细胞的获得方法，包括如下步骤：步骤一、将p53敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞通过显微注射的方法，注射到野生型小鼠囊胚中得到重构胚胎；步骤二、将重构胚胎移植回0.5天的假孕母鼠的输卵管或2.5天假孕母鼠的子宫中，在胚胎发育到E6.5天时进行解剖，分离上胚层区域；步骤三、将上胚层区域种在培养基中培养，最终形成小鼠单倍体上胚层干细胞。本发明通过p53‑KO的方法，有效抑制了单倍体干细胞在体内分化过程中的自发二倍化，并借助嵌合体技术在体外成功建立了来源于着床后上胚层组织的小鼠单倍体上胚层干细胞系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小鼠单倍体干细胞的获得方法。

背景技术

哺乳动物单倍体细胞系因其产生纯合基因型的优势，在过去十年中引起了广泛关注，因此被广泛用于正向和反向遗传学筛选。单倍体胚胎干细胞(haESCs)是一种来源于着床前单倍体囊胚的单倍体多能干细胞，因其纯合子和干细胞的优势在基因功能筛查等方面彰显了巨大的优势。但是，haESCs作为未分化的多能干细胞，在一些谱系特异性遗传学筛选方面存在着局限性。

小鼠上胚层干细胞(EpiSCs)来源于着床后的上胚层组织(Epiblast)，在形态和多种分子生物学属性方面与人类胚胎干细胞(ESCs)极其相似而引起广泛关注。EpiSCs处于“primed”多能性状态，不同于处于“naive”多能性状态的小鼠ESCs，因此EpiSCs常用于研究重编程机制。作为一类新颖的多能干细胞，EpiSCs能够在体内外实验中分化到三胚层的多个组织谱系。因此，建立小鼠单倍体上胚层干细胞系将为通过遗传筛选研究重编程机制、X染色体失活等关键生物学过程中的关键基因提供极大的便利。然而，目前尚未有植入后胚胎建立小鼠单倍体上胚层干细胞系(haEpiSCs)报道，其主要原因是单倍体干细胞在体内分化过程中发生了自发二倍化，回到了二倍体的状态所致。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种小鼠单倍体干细胞的获得方法。本发明通过p53-KO的方法，有效抑制了单倍体干细胞在体内分化过程中的自发二倍化，并借助嵌合体技术在体外成功建立了来源于着床后上胚层组织的小鼠单倍体上胚层干细胞系。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种小鼠单倍体干细胞的获得方法，包括如下步骤：

步骤一、将p53敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞通过显微注射的方法，注射到野生型小鼠囊胚中得到重构胚胎；

步骤二、将重构胚胎移植回0.5天的假孕母鼠的输卵管或2.5天假孕母鼠的子宫中，在胚胎发育到E6.5天时进行解剖，分离上胚层区域；

步骤三、将上胚层区域种在培养基中培养，最终形成小鼠上胚层干细胞。

进一步的改进，所述步骤一包括如下步骤：

a.对CD1背景的母鼠进行超数排卵处理，随后将超排母鼠与公鼠进行合笼，合笼第二天留下见栓母鼠单独饲养；

b.见栓第二天“安乐死法”处死见栓母鼠后，取见栓母鼠输卵管并用M2操作液将输卵管中的2-细胞时期的胚胎冲出，转移至KSOM培养基中继续培养至囊胚阶段；

c.在每个囊胚中注射8-12个p53敲除的单倍体胚胎干细胞构成重构胚。

进一步的改进，所述步骤二中，将重构囊胚移植到2.5天假孕母鼠鼠的子宫内，继续饲养至E6.5天，分离上胚层干细胞。

进一步的改进，所述步骤三中，将上胚层干细胞在上胚层干细胞系培养基中培养，每2-3天，使用1mg/ml胶原酶IV进行传代；培养液采用流式细胞术分选得到小鼠上胚层干细胞。

进一步的改进，所述超数排卵处理即在假孕母鼠腹腔注射PMSG激素，48小时后，再次腹腔注射hCG激素。

附图说明