[发明专利]一种小鼠单倍体干细胞的获得方法

权利要求书

1.一种小鼠单倍体干细胞的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将p53敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞通过显微注射的方法，注射到野生型小鼠囊胚中得到重构胚胎；

步骤二、将重构胚胎移植回0.5天的假孕母鼠的输卵管或2.5天假孕母鼠的子宫中，在胚胎发育到E6.5天时进行解剖，分离上胚层区域；

步骤三、将上胚层区域种在培养基中培养，最终形成小鼠单倍体上胚层干细胞。

2.如权利要求1所述的小鼠单倍体干细胞的获得方法，其特征在于，所述步骤一包括如下步骤：

a. 对CD1背景的母鼠进行超数排卵处理，随后将超排母鼠与公鼠进行合笼，合笼第二天留下见栓母鼠单独饲养；

b．见栓第二天“安乐死法”处死见栓母鼠后，取见栓母鼠输卵管并用M2操作液将输卵管中的2-细胞时期的胚胎冲出，转移至KSOM培养基中继续培养至囊胚阶段；

c.在每个囊胚中注射8-12个p53敲除的单倍体胚胎干细胞构成重构胚。

3.如权利要求1所述的小鼠单倍体干细胞的获得方法，其特征在于，所述步骤二中，将重构囊胚移植到2.5天假孕母鼠的子宫内，继续饲养至E6.5天，分离上胚层区域。

4.如权利要求1所述的小鼠单倍体干细胞的获得方法，其特征在于，所述步骤三中，将上胚层区域在单倍体上胚层干细胞系培养基中培养，每2-3天，使用1 mg/ml 胶原酶 IV进行传代；培养液采用流式细胞术分选得到小鼠单倍体上胚层干细胞。

5.如权利要求2所述的小鼠单倍体干细胞的获得方法，其特征在于，所述超数排卵处理即在假孕母鼠腹腔注射PMSG激素，48小时后，再次腹腔注射hCG激素。