[发明专利]植物叶片离体培养表达蛋白的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。本发明可以充分将植物叶片进行离体培养，并正常表达产生所需要的重组蛋白。在培养的垂直空间占用上具有非常大的优势，同时不再需要营养土或营养液，成本低廉，价格优势明显，操作简单便捷，适用于大规模的商业化生产使用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。

背景技术

植物作为一种蛋白生产的生物反应器，具有广阔的应用前景。目前生产重组蛋白的植物培养主要是以建造人工气候室或者培养间、培养箱为主。除了生菜等少数蔬菜可以用水培进行大量生产之外，绝大多数植物依然采用的是土培辅助以LED人工光源的方式或者直接在大田进行种植，进行重组蛋白的生产。

现有的几个以植物源重组蛋白为主的公司，如Medicago、Ibio等均在培养间内，利用人工LED光源、营养土培养本氏烟、生菜等植物，并采用农杆菌真空浸润法将需要的表达载体导入到植物叶片细胞中。这样的方法可以在植物上快速生产重组蛋白，不受环境条件和土地资源的制约。但这样子的培养方式也存在一定的缺陷：1、营养土比较昂贵且不易回收利用，成本较高；2、营养土的存在给真空浸润造成很多技术难题，增加设备成本；3、植物在立体式的培养模式下，增加了生产场地的空间占用消耗，增加了生产成本。因此，一种更加高效、集约、低成本的植物培养体系和重组蛋白生产体系是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，利用此方法可以更加简单操作、低成本、短周期地生产植物源重组蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；

步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；

步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；

所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；

步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia 1300。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μl ddH₂O、25μl KOD OneTM PCR Master Mix、1μl 10μM上游引物、1μl 10μM下游引物、1μl 100ng/μl的含有GFP的质粒模板。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98度10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述含有所述重组蛋白的表达载体的序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述收集菌液浸润到植物叶片具体为：待菌液的OD600＝0.8时，8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液重悬，调节OD600＝0.6，将菌液浸润到植物叶片中；所述浸润缓冲液包括10mM MES，10mM MgCl2，1μM乙酰丁香酮。