[发明专利]植物叶片离体培养表达蛋白的方法

权利要求书

1.植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；

步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；

步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；

所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；

步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia 1300。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μl ddH₂O、25μl KOD OneTM PCR Master Mix、1μl 10μM上游引物、1μl 10μM下游引物、1μl 100ng/μl的含有GFP的质粒模板。

5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98度10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述含有所述重组蛋白的表达载体的序列如SEQ ID No.3所示。

7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中所述收集菌液浸润到植物叶片具体为：待菌液的OD600＝0.8时，8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液重悬，调节OD600＝0.6，将菌液浸润到植物叶片中；所述浸润缓冲液包括10mM MES，10mMMgCl2，1μM乙酰丁香酮。

8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3中所述培养的条件为：温度28℃，相对湿度100％，光照强度为250μmoles/m²/s，明暗时间为16h/8h。

9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物叶片为烟草叶片。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述支撑渗水部件(5)的厚度为1～3cm；所述锁水部件(3)的厚度为1～3cm；所述底部承载部件(2)的厚度为10～20cm。