[发明专利]一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新中的应用方法

权利要求书

1.一种小分子在促进胚胎干细胞自我更新状态中的应用方法，其特征在于，在含有10％FBS的DMEM培养基中，加入Spautin-1小分子来维持小鼠胚胎干细胞自我更新的状态。

2.根据权利1所述的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎干细胞在Spautin-1小分子条件下的传代和培养：

(1)取1.5ml 0.1％浓度的明胶包细胞培养板，置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱，包板30min；

(2)取生长密度在70-80％的P24代小鼠胚胎干细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤一次，除去残留的培养液；

(3)加入1ml 0.1％浓度的胰蛋白酶，消化细胞2min左右，至细胞边缘浮起，用移液器吹打细胞，吸取细胞悬液，转移至盛有2ml DMEM血清培养液的15ml离心管中，继续吹打混匀，终止消化；

(4)1000rpm，离心3min后，弃去上清，加入2ml DMEM培养液重悬细胞，利用细胞计数板计数，并以此计算出细胞密度；

(5)取出包好的培养板，弃去明胶，向培养板中加入2ml DMEM培养液；

(6)向两组细胞培养板中分别加入4×10⁵个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；

(7)向其中一组细胞培养板中分别加入1μM、2μM、3μM、4μM浓度Spuatin-1小分子处理的细胞，水平十字形晃动，使其混合均匀；

(8)向另一组细胞培养板中分别添加2μM Spautin-1+3μM CHIR99021小分子组合，以及2μM Spautin-1+1μM PD0325901小分子组合，水平十字形晃动，使其混合均匀；

(9)将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱内培养。

3.根据权利要求2中(7)所述的方法，其特征在于，加入的Spautin-1小分子为2μM时，为促进小鼠胚胎干细胞自我更新的最佳处理浓度。

4.根据权利要求2中(8)所述的方法，其特征在于，加入Spautin-1与CHIR99021两种小分子组合或Spautin-1与PD0325901两种小分子组合均能够维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。

5.根据权利要求1所述一种小分子在促进小鼠胚胎干细胞自我更新状态中的应用方法，其特征在于，细胞自我更新状态与细胞特性检测方法如下：

(1)形态观察，使用Leica DMIL倒置显微镜分别对添加不同浓度Spautin-1进行处理的小鼠胚胎干细胞进行观察选择最佳培养浓度；

(2)使用Leica DMIL倒置显微镜分别对负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)以及实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)、实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)的细胞形态进行观察；

(3)碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)染色检测自我更新状况，具体方法如下：

a、正、负对照组和实验组接种适量的细胞，培养一定时间后即可进行AP染色；

b、按照AP染色试剂盒说明配制BCIP/NBT染色工作液；

c、弃去细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤3-5次，每次3-5min，加入500μl 4％的多聚甲醛固定细胞1-2min，弃去固定液，再用PBS洗涤3-5次，每次3-5min；

d、最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖细胞；

e、室温避光孵育30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅；

f、去除BCIP/NBT染色工作液，用PBS洗涤1-2次即可终止显色反应；

g、最后加入适量PBS后，将培养板放在Leica DMIL倒置显微镜观察负对照组(不添加小分子)、正对照组(仅添加Spautin-1小分子)与实验组A(添加Spautin-1+CHIR99021两种小分子)和实验组B(添加Spautin-1+PD0325901两种小分子)细胞染色情况，判断细胞自我更新状态。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DMEM包括以下组分：10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠，100单位的青霉素和100μg的链霉素。