[发明专利]一种神经干细胞的取材培养方法

权利要求书

1.一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. 选取合格的人工流产胚胎组织

选择年龄20-35岁的妇女，妊娠 2周以上、8周以内，经常规手术前检查无禁忌症；经负压吸引出的胚胎组织离体不超过4小时，柔软、粉红的绒毛组织和类纽扣形的胚胎组织完好；

b. 无菌条件下分离胚胎组织

在无菌条件下剥除血管、筋膜组织，冲洗去血液，分离胚胎组织，再找到并分离外胚层形成的神经板或者神经管；

c. 获得符合接种浓度的单细胞悬液

无菌条件下取出室管膜层组织并缓冲液清洗后，再用机械分离或酶消化分离法分离神经管上皮细胞，以1×10⁵个/毫升的密度接种于DMEM/F12无血清培养基中，同时添加N2、NGF、b-FGF或EGF促有丝分裂诱导因子，在湿度100%、温度37℃、5%CO₂条件下培养细胞；

d. 传代培养

每隔3天换液传代一次，传代时使用机械分离法和酶消化分离法中的一种或两种方式分散细胞；

e. 每天倒置显微镜观察细胞生长情况，根据生长情况判断是否有神经干细胞产生，待生长总数量级达10⁶-10⁷时，稳定传代3代以上时，鉴定神经干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，细胞悬液用消毒的筛网过滤杂质。

3.根据权利要求2所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：筛网的孔径为200目。

4.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，所述机械分离法的具体操作如下：采用剪切、轻柔吹打的方法将组织分离，再将组织放入离心管中自然沉淀1-2分钟，弃掉最下层沉淀组织，吸取上层细胞混悬液，调整细胞密度为1×10⁵/ml，接种到神经干细胞完全培养基，于37℃、5%CO₂条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。

5.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，酶消化分离法的具体操作如下：将组织放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，于37℃条件下消化5分钟，镜下见细胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，再用无血清DMEM/F12培养基清洗，用神经干细胞完全培养基调整细胞密度为1×10⁵/ml，于37℃、5%CO₂条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。

6.根据权利要求4、5任一所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：所述神经干细胞完全培养基为含有20ng/ml BFGF和20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基。