[发明专利]大菱鲆养殖用益生菌、饲料及无抗化养殖方法

权利要求书

1. 一株大菱鲆养殖用益生菌，其特征在于，命名为纳豆芽孢杆菌ND2，经鉴定为枯草芽孢杆菌属，该菌株于2020年06月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2020184；所述纳豆芽孢杆菌ND2为通过培养分离方法从日本纳豆中筛选取得的枯草芽孢杆菌菌株，所述纳豆芽孢杆菌ND2对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌具有抑制效果。

2.一种大菱鲆养殖用饲料，其特征在于，包括A组分饲料，所述A组分饲料包括益生菌组分，所述益生菌组分的原料组分包括如权利要求1所述的大菱鲆养殖用益生菌。

3. 根据权利要求2所述的大菱鲆养殖用饲料，其特征在于，所述益生菌组分的原料组分还包括凝结芽孢杆菌 BNCC 136363，所述纳豆芽孢杆菌ND2与所述凝结芽孢杆菌BNCC136363的活菌数量比为1:2；所述A组分饲料的活菌数量大于或等于10⁷CFU/kg。

4.根据权利要求3所述的大菱鲆养殖用饲料，其特征在于，还包括B组分饲料，所述B组分饲料的原料组分包括中草药提取物组分，所述中草药提取物组分包括牛至精油、黄芪多糖和黄酮；所述牛至精油提取自牛至，所述牛至精油在B组分饲料中的含量为1ml/kg；所述黄芪多糖和黄酮分别采用水蒸汽蒸馏法提取自黄芪和甘草，所述黄芪多糖和黄酮质量比为1.5:1，所述黄芪多糖和黄酮在B组分饲料中的总含量为0.7wt%-0.9wt%。

5.根据权利要求4所述的大菱鲆养殖用饲料，其特征在于，所述A组分饲料和B组分饲料均包括营养成分，所述营养成分的组分及其重量份数包括：粗蛋白40份，粗脂肪28份，粗灰分10份，粗纤维3份、总磷1.5份，钙1.5份，所述营养成分还包括微量元素，所述微量元素包括Cu、Mn、Zn、I，所述微量元素在所述饲料中的总含量为6mg/kg。

6.一种大菱鲆无抗化养殖方法，其特征在于，采用如权利要求2至5中任一项所述的大菱鲆养殖用饲料。

7.根据权利要求6所述的大菱鲆无抗化养殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

疫苗制备：从养殖区的患病大菱鲆体内分离、筛选出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌，对所得杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株进行培养后，对菌液进行灭活以制备灭活疫苗；

疫苗接种：对养殖区内的健康大菱鲆经腹部腹腔注射灭活疫苗，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中；

饲料饲养：正常饲养完成疫苗接种的大菱鲆，并采用所述大菱鲆养殖用饲料对完成疫苗接种的大菱鲆进行饲喂。

8.根据权利要求7所述的大菱鲆无抗化养殖方法，其特征在于，所述大菱鲆养殖用饲料包括所述A组分饲料和B组分饲料，所述饲料饲养步骤包括多个饲喂周期，一个所述饲喂周期中，采用所述A组分饲料饲喂10-12天，停喂所述A组分饲料3-4天，再采用所述B组分饲料饲喂5-7天，停喂所述B组分饲料3-4天；一个所述饲喂周期结束后再重复进行下一个所述饲喂周期。

9.根据权利要求7所述的大菱鲆无抗化养殖方法，其特征在于，包括病原菌检测步骤，所述大菱鲆无抗化养殖方法包括以下步骤：

病原菌检测：在养殖区的患病大菱鲆中取样，对样本所含细菌进行检测，以确定致病的病原菌，所述病原菌检测包括对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的检测，以确定病原菌包括杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌；

疫苗制备：从养殖区的患病大菱鲆体内分离出杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌，通过人工感染试验筛选出对健康大菱鲆具有较强毒性的杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株；对所得杀鲑气单胞菌菌株和大菱鲆弧菌菌株分别进行繁殖培养后，将两种菌液分别进行离心，离心速度为3500 r/min，离心所得沉淀物经反复清洗后，用PBS缓冲液分别稀释为活菌含量1×10⁹ cfu/mL的杀鲑气单胞菌菌液和大菱鲆弧菌菌株菌液；分别在所得的两种菌液中添加0.2%的甲醛溶液，28℃下灭活24h，得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液，取杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液各100µL，分别接种在TSB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中，放置24h后进行观察，培养皿中无菌落长出，所得杀鲑气单胞菌灭活菌液和大菱鲆弧菌菌株灭活菌液即可作为杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗；

疫苗接种：所得杀鲑气单胞菌灭活疫苗和大菱鲆弧菌菌株灭活疫苗按体积比1:1的混合液后，加入与所述混合液等体积的弗氏佐剂得注射疫苗，对养殖区内的健康大菱鲆经腹部注射0.1mL注射疫苗即完成免疫接种，将免疫接种后的大菱鲆放回养殖池中；

饲料饲养：所述饲料饲养步骤的每日饲料投喂量为鱼体重的2wt%-5wt%，饲养环境的水温为14℃~19℃，盐度29-32，pH为7.8-8.2。