[发明专利]一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法

权利要求书

1.一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.优化猪γ干扰素基因序列；

S2.构建表达载体pPICZαA-pIFNg：双酶切pPICZαA表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg；

S3.构建表达载体pPIC9K-pIFNg：双酶切pPIC9K表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg；

S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌：单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合博来霉素加压筛选，筛选出菌株pIFNg-01；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合遗传霉素加压筛选，筛选出表达量最高的菌株pIFNg-02；

S5.诱导表达重组猪γ干扰素：挑取步骤S4中的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，制备种子液，种子液发酵培养，饲喂碳源，甲醇诱导表达。

2.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述优化后猪γ干扰素基因序列包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中使用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒。

4.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S3中使用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用EcoRI和NotI双酶切鉴定阳性重组质粒。

5.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中还包括将单菌落接种培养后，用甲醇诱导表达，取发酵液上清电泳并染色，比较猪γ干扰素表达量。

6.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中博来霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml。

7.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中遗传霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml。

8.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体的酶为PmeI限制性内切酶；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体的酶为Sal I限制性内切酶。

9.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中感受态细胞为X33毕赤酵母、GS115毕赤酵母或KM71毕赤酵母中的一种。

10.根据权利要求1～9任一项所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述的表达猪γ干扰素的毕赤酵母的保藏编号为：GDMCCNO.60827。