[发明专利]一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法；包括：1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；2)在无菌环境下，采用该重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于共培养基上生长，得到膨大的子叶外植体；3)将膨大的外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；4)将伸长的丛生芽分离成单株，转移、进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；6)通过草铵膦试纸和PCR双重鉴定T0代甜瓜转基因幼苗，得到完成遗传转化的株系。利用本发明的方法可以得到稳定转化的甜瓜幼苗。

技术领域

本发明属于植物分子遗传育种和基因工程技术领域，涉及一种甜瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法，具体涉及一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物，是重要的园艺作物之一。由于甜瓜属作物的遗传基础狭窄，传统育种技术对新品种的培育受限于种内与种间杂交隔离，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。此外，传统育种技术耗时较长，效率较低。与之相比，转基因技术具有高效性、精准性等优点，且逐渐被用于农作物的品种改良中。然而，甜瓜的遗传转化技术尚不成熟，相关研究工作也进展缓慢。

对现有专利文献检索发现，CN102080100A公开了一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，包括以甜瓜子叶或子叶节为外植体，将外植体浸入农杆菌菌液中浸泡，随后在培养基中诱导、培养芽，待芽长到高1-3cm高时，在培养基中生根、移栽。该方法提高了甜瓜的转化效率，解决了甜瓜利用农杆菌转化的难度问题。然而，该方法在转基因植株鉴定上采用PCR技术，工作量大，费时费力；且转化效率提升有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：

1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；

2)在发芽培养基中促进甜瓜种子发芽得到子叶；在无菌环境下，采用步骤1)获得的重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于“植物-农杆菌共培养培养基”上生长，得到膨大的子叶外植体；

3)将膨大的子叶外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；

4)将伸长的丛生芽分离成单株，并(转移至更大空间的容器中)进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；

5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；

6)通过草铵膦试纸和PCR双重鉴定T0代甜瓜转基因幼苗，得到完成遗传转化的株系。

作为本发明的一个实施方案，步骤6)具体包括如下步骤：

6-1)用草铵膦喷洒步骤5)中的甜瓜幼苗，不枯死的幼苗即为遗传转化的植株，发生枯死的幼苗不为遗传转化植株；

和/或，6-2)将步骤5)中的甜瓜幼苗叶片用水磨碎，将草铵膦试纸条放入研磨液中，测试结果产生阳性目标条带的即为遗传转化的植株，无目标阳性条带的不为遗传转化植株；

和/或，6-3)提取步骤5)中的甜瓜幼苗叶片DNA，利用PCR扩增表达载体上的特异DNA序列，并测序；有条带且测序结果与载体序列一致的为遗传转化的植株；有条带但测序不正确，或没用扩增条带的不为遗传转化植株。