[发明专利]一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)构建带有BlpR基因的重组表达载体，转入农杆菌得到重组菌株；

2)在发芽培养基中促进甜瓜种子发芽得到子叶；在无菌环境下，采用步骤1)获得的重组农杆菌侵染甜瓜子叶近轴端片段，将侵染后的子叶片段置于植物-农杆菌共培养培养基上生长，得到膨大的子叶外植体；

3)将膨大的子叶外植体转移至分化筛选培养基上培养，诱导出丛生芽；

4)将伸长的丛生芽分离成单株，进一步筛选培养，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；

5)将具有甜瓜地上部分的幼苗转入生根培养基中，诱导根的分化，得到T0代甜瓜转基因幼苗；

6)通过草铵膦试纸和PCR双重鉴定T0代甜瓜转基因幼苗，得到完成遗传转化的株系。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，步骤6)具体包括如下步骤：

6-1)用草铵膦喷洒步骤5)中的甜瓜幼苗，不枯死的幼苗即为遗传转化的植株，发生枯死的幼苗不为遗传转化植株；

和/或，6-2)将步骤5)中的甜瓜幼苗叶片用水磨碎，将草铵膦试纸条放入研磨液中，测试结果产生阳性目标条带的即为遗传转化的植株，无目标阳性条带的不为遗传转化植株；

和/或，6-3)提取步骤5)中的甜瓜幼苗叶片DNA，利用PCR扩增表达载体上的特异DNA序列，并测序；有条带且测序结果与载体序列一致的为遗传转化的植株；有条带但测序不正确，或没用扩增条带的不为遗传转化植株。

3.根据权利要求1或2所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，

步骤2)中，用于侵染的重组农杆菌先后经LB、B5液体培养基培养至菌液OD值为0.4-0.6。

4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，用于侵染的重组农杆菌先在含50-150mg/L利福平和50-150mg/L壮观霉素的LB液体培养基过夜培养，再吸取该过夜培养得到的侵染液0.5-5mL，加入100-150mL B5液体培养基中，再加入40-80ul400mM的乙酰丁香酮，再次过夜培养至菌液OD值为0.4-0.6。

5.根据权利要求1中所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，

所述发芽培养基为MS固体培养基，不含任何激素；

和/或，所述植物-农杆菌共培养培养基为含有0.4-0.6mg/L 6-BA和0.05-0.15mg/LIAA的B5固体培养基；

和/或，所述分化筛选培养基为含有0.4-0.6mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L IAA、100-200mg/L特美汀，200-300mg/L头孢噻肟和3.5-5mg/L草铵膦的B5固体培养基；

和/或，所述生根培养基为B5固体培养基，不含任何激素。

6.根据权利要求1中所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，步骤2)中，发芽培养基中催芽培养时间为20-24小时；催芽和子叶共培养均在光照条件下进行。

7.根据权利要求1中所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，所述甜瓜为栽培甜瓜或野生甜瓜。

8.根据权利要求1中所述的农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法，其特征在于，步骤1)中，所述重组表达载体能表达BlpR蛋白质；所述BlpR蛋白质为序列表中SEQ ID NO.1所示蛋白质。

9.一种试剂，为所述发芽培养基、植物-农杆菌共培养基、分化筛选培养基和生根培养基组成的成套培养基；所述发芽培养基为MS固体培养基；所述植物-农杆菌共培养基为含有0.4-0.6mg/L 6-BA和0.05-0.15mg/L IAA的B5固体培养基；所述分化筛选培养基为含有0.4-0.6mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L mg/L IAA、100-200mg/L特美汀，200-300mg/L头孢噻肟和3.5-5mg/L草铵膦的B5固体培养基；所述生根培养基为B5固体培养基。

10.下述任一应用

Y1)权利要求1-8中任一所述方法在甜瓜育种中的应用；

Y2)权利要求9中所述试剂在甜瓜育种中的应用；

Y3)权利要求9中所述试剂在制备甜瓜遗传转化产品中的应用；

Y4)权利要求9中所述试剂在甜瓜遗传转化中的应用。