[发明专利]鸭瘟病毒易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用

说明书

本发明公开了鸭瘟病毒易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用。本发明利用四个单倍型鸭生产的11日龄鸭胚在添加碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和干细胞因子同时培养的基础上成功构建得到具有干细胞分化能力、性能稳定的胚肝源的间充质干细胞系。针对细胞系的特征性病变观察表明，所构建的干细胞系能支持DEV复制。本发明进一步将DEV分别接种于所获得的细胞系最终筛选得到更适合DEV增殖的细胞系，其微生物保藏编号是CGMCC No.18304。本发明所构建的鸭胚肝间充质干细胞系本身无病原学潜在污染、遗传背景清晰、性能稳定，适合DEV的增殖和培养，能应用于商业化的鸭瘟病毒的增殖和培养。

技术领域

本发明涉及鸭源胚肝间充质干细胞系，尤其涉及适于鸭瘟病毒或鸭甲型肝炎病毒增殖的易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其构建方法和应用，属于鸭源胚肝间充质干细胞系的构建和应用领域。

背景技术

鸭瘟(Duck Plague，DP)也被称为鸭病毒性肠炎，是由疱疹病毒1型鸭肠炎病毒(Duck Enterovirus，DEV)引起的急性、慢性和高度传染性疾病。DP可使不同年龄的家鸭、野鸭、天鹅、鹅和其它水禽发病，主要病理变化为血管损伤，淋巴器官损伤，消化道粘膜出血，严重腹泻和实质器官退行性病变。临床症状包括眼睑局部闭合，畏光，极度口渴，食欲不振，共济失调，鼻腔有分泌物，羽毛下垂以及水样腹泻等，产蛋量和孵化率下降，死亡率高，给世界养鸭业带来重大的经济损失。

鸭甲型肝炎病毒(DHAV)属于小RNA病毒科、小RNA病毒属，有三种基因型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在中国大陆，鸭病毒性肝炎(DVH)主要由DHAV-1和DHAV-3引起。DHAV-1主要影响4周龄以下的雏鸭，对1周龄以下的雏鸭死亡率高达95％。

HBK鸭是中国国内最早培育成功的实验动物标准化绍兴麻鸭鸭群——该鸭群已在正压环境下连续繁殖了8个世代，排除了9种特定病原微生物及其抗体，其质量符合中国实验动物学会发布的“T/CALAS 18-2017实验动物SPF鸭微生物学监测总则”、“T/CALAS 37-2017实验动物SPF鸭遗传学质量监测”和“T/CALAS 17-2017实验动物SPF鸭配合饲料”以及黑龙江省标准“DB23/T 2057.6-2017实验动物鸭饲养隔离器通用技术要求”。根据组织相容性复合体(MHC)的核心基因MHC I类分子重链编码基因(uaa)以及与其连锁的2个抗原转运相关体基因(tap1和tap2)的基因型，该鸭群分为4个单倍型，分别命名为Hvri：HB1(本文简称B1，下同)、Hvri：HB2(B2)、Hvri：HB3(B3)和Hvri：HB4(B4)。经过连续5个世代的半同胞兄妹交配方式，其生物学特性和遗传背景均已非常稳定。

无论是商业化生产鸭瘟疫苗，还是实验室内禽病病毒田间流行株的分离，目前存在几个不可回避的技术瓶颈：

1、DEV只能利用鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF)，或利用鸡胚制备鸡胚成纤维细胞(CEF)进行体外培养和增殖。如果鸭胚或鸡胚本身携带某种或某几种病原微生物，则由此增殖获得的DEV疫苗，不仅因可能污染了其他病原微生物而给被免疫鸭群带来生物安全风险；或因不同微生物间的相互影响而影响DEV的增殖能力，从而减低疫苗的效价。

2、DHAV-1强毒在鸭胚中连续传代会降低致病性，不宜用胚培养强毒。DHAV-1疫苗株能在鸭胚肝细胞、鸭胚内皮细胞和DEF增殖，但传代次数有限。DHAV-3强毒株与弱毒株均能感染DEF，但不产生明显的细胞病变，不易观察。

3、DEF和CEF都是有限传代细胞系，通常只能传代1-2代，其质量和活性受生产工艺和培养条件的密切影响，从而进一步影响DEV的含量和活力。

4、已有多个国内外研究报告表明，鸭的MHC遗传背景对DP的致病性或DEV的复制能力有很大相关性。