[发明专利]一种外周血单个核细胞的分离及培养方法

说明书

本发明提供一种外周血单个核细胞的分离及培养方法，涉及生物技术细胞培养领域。该外周血单个核细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：S1.采集外周血；S2.离心分离；S3.提取外周血单个核细胞；S4.对外周血单个核细胞进行纯化；S5.制备细胞培养基；S6.进行细胞培养；S7.进行保存。通过设置有ALK抑制剂、GSK‑3抑制剂，可以对细胞培养过程中的细胞病变进行抑制，阻止病变细胞过度活化、进行快速增值，在培养过程中没有添加动物血清，减少在培养过程中，从动物身上得到的病毒的可能，保证了培养过程中的安全，在分离完成后，对外周血单个核细胞进行多次清洗与纯化，使培养时的细胞中基本不含有其他杂质细胞，使培养的细胞较为纯净。

技术领域

本发明涉及生物技术细胞培养领域，具体为一种外周血单个核细胞的分离及培养方法。

背景技术

外周血是除骨髓之外的血液，来源丰富，采集方便。通过外周血分离培养的免疫细胞具有增殖速度快、安全性、持久性、适应性、全身性等特点，与传统的放疗等方法相比，通过主动免疫能够激发全身性的抗肿瘤效应，作用范围更加广泛，特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤；副作用很小。外周血单个核细胞是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。

在进行外周血单个核细胞的培养过程中，由于光照、温度以及环境中的一些变化，使得细胞在培养过程中可能会产生变异，使得细胞培养成为癌细胞或病变细胞，使细胞培养失败，而在现有得的外周血单个核细胞的培养过程中，加入动物的血清进行培养，使细胞便于受到外界的病菌、病毒的感染，造成细胞病变。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种外周血单个核细胞的分离及培养方法，解决了培养细胞中易于病变的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种外周血单个核细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：

S1.采集外周血：在无菌环境下，对外周血进行提取，向其中加入抗血凝素；

S2.离心分离：向采集到的外周血进行稀释，然后向其中加入聚蔗糖-泛影葡胺分层液，通过聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心法进行外周血单个核细胞进行分离，使血液形成明显分层；

S3.提取外周血单个核细胞：用一支毛细吸管对分层中的灰白色层进行吸取，将单个核细胞吸入到毛细吸管中，提取外周血单个核细胞；

S4.对外周血单个核细胞进行纯化：通过加入平衡盐溶液进行清洗，通过二次离心将混杂的血小板去除，得到纯化的外周血单个核细胞；

S5.制备细胞培养基：通过将基础细胞培养基干粉、谷氨酰胺、生长因子、维生素、ALK抑制剂、GSK-3抑制剂、胰岛素、白蛋白、碳酸氢钠、人转铁蛋白按照一定的比例进行混合，形成培养液。

S6.进行细胞培养：在培养基中重悬外周血单个核细胞，对外周血单个核细胞进行培养；

S7.进行保存：将培养后的细胞进行进行离心收集，向其中加入细胞冻存液，通过在冰箱中进行冷冻一夜，然后放置于液氮中进行长期保存，比那与后期进行取用。

优选的，所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心法的离心温度为15℃～20℃，离心速度为1800r/min～2000r/min,离心时间为20min～25min。

优选的，所述二次离心的离心温度为20℃～25℃，离心速度为1200r/min～1500r/min，离心时间8min～12min，离心次数四次。

优选的，所述冰箱冷冻温度为-60℃～-80℃，所述平衡盐溶液为磷酸缓冲盐溶液、细胞冲洗液中的一种。