[发明专利]两个定点敲除水稻OsMAP65-3.1基因的sgRNA的oligo DNA组

说明书

本发明提供一种敲除水稻OsMAP65‑3.1(LOC_Os05g47970)基因的两个sgRNA。针对水稻OsMAP65‑3.1基因设计两个基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，通过农杆菌转化水稻，实现对水稻OsMAP65‑3.1基因的敲除。其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示。本发明通过CRISPR‑CAS9技术对水稻内源基因OsMAP65‑3.1进行编辑，获得了两种OsMAP65‑3.1‑1、OsMAP65‑3.1‑2敲除突变体。利用本发明制备的sgRNA能高效、快速、精确靶向水稻OsMAP65‑3.1基因，在基础研究(水稻有丝分裂)和生产实践(水稻高产育种和抗逆育种)上具有一定的意义。

技术领域

本发明明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及两个基于CRISPR-CAS9技术定点敲除水稻OsMAP65-3.1基因的sgRNA的oligo DNA组及应用。

背景技术

植物细胞的胞质分裂是由成膜体引起的，成膜体是体细胞中有丝分裂细胞的一个反平行微管阵列，反映了动态微管网络最显著的特征之一。MAP65蛋白可以形成一个二聚体，在细胞分裂过程中促进成膜体和其他微管阵列的反平行微管捆绑，因此，可以在成膜体中桥接重叠的微管。在植物发育过程中，MAP65家族成员MAP65-3在所有分裂细胞中均有表达，表达受转录和转录后机制的双重调控，MAP65-3在所有植物器官的有丝分裂和胞质分裂中都起着关键作用。此外，MAP65-3基因在线虫诱导大细胞形成的早期阶段表达。MAP65-3的单独缺失会严重影响胞质分裂和有丝分裂，在缺乏MAP65-3的突变细胞中，反平行微管在中枢纺锤体和成膜体中的结合被大量取消，成膜体微管阵列紊乱，长度增加，与野生型细胞相比，成膜体中部间隙更大，维管束排列松散。

随着在烟草中大约65-Kd的MAP65蛋白的初次发现，预测拟南芥基因组编码9个同源蛋白，与烟草蛋白具有28～79％的氨基酸同源性，在拟南芥的9种MAP65蛋白中，MAP65-3蛋白具有胞质分裂作用。在拟南芥中，MAP65-3不仅是MAP激酶的底物，对MAP65亚型也有作用。因此，当细胞板组装完成时，微管相关蛋白的微管稳定功能必须被下调，以便使成膜体微管正常解聚。微管相关蛋白修饰所有阵列或一个特定阵列，主要是在拟南芥。这些蛋白中的一些要么与其他邻域的生物体内的微管相关蛋白有着遥远的联系，要么是特定于开花植物。不幸的是，在鉴定水稻和其他单子叶植物中与微管相关的蛋白质方面进展甚微。

在与微管相互作用的蛋白质中，与拟南芥相比，水稻具有更多编码MAP65家族成员的基因，且已有11个水稻基因被识别编码MAP65/Ase1p家族，OsMAP65-3.1基因为其中之一，参与编码MAP65-3家族成员。胞质分裂是维持个体正常生长发育的基础，是保证动物和高等植物物种连续稳定的重要过程，而水稻作为我国重要的粮食作物，研究OsMAP65-3.1基因在水稻中的功能对水稻的正常生长和保证产量，以及敲除OsMAP65-3.1获得突变体分析其功能和在作用机制具有重要意义。本发明通过设计sgRNA构建基因编辑载体、转基因技术和CRISPR-CAS9技术获得转基因植株、测序分析获得OsMAP65-3.1基因编辑(敲除)的植株及序列编辑情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲除水稻基因OsMAP65-3.1的方法，提供了一种基于CRISPR-CAS9技术敲除水稻OsMAP65-3.1的sgRNA以及用于敲除水稻OsMAP65-3.1基因的载体。

使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsMAP65-3.1的方法，其特征在于，包括如下步骤：