[发明专利]一种定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组

说明书

本发明提供一种敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组。针对水稻OsAUR2基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsAUR2基因的敲除。其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR‑CAS9技术对水稻内源基因OsAUR2进行编辑，获得了OsAUR2敲除突变体。利用本发明制备的sgRNA能高效、快速、精确靶向水稻OsAUR2基因，在基础研究(水稻有丝分裂)和生产实践(水稻高产育种和抗逆育种)上具有一定的意义。

技术领域

发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种基于CRISPR-CAS9技术定点敲除水稻OsAUR2基因的sgRNA的oligo DNA组及应用。

背景技术

Aurora激酶存在于所有真核生物，在进化上非常保守，是有丝分裂的关键决定因子。Aurora激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，酵母中只有一个Aurora激酶,而多细胞真核生物至少有两个功能不同成员。Aurora激酶是细胞调节有丝分裂必需的激酶，特别是染色体分离过程。此外，它们还参与了减数分裂过程。目前，Aurora激酶在动物细胞中的功能研究较为清楚，尤其是人类细胞。人类细胞中有三个Aurora激酶成员：Aurora A，Aurora B和Aurora C。Aurora激酶的缺失可能导致细胞分裂的失败损害胚胎发育，而在许多癌症中Aurora激酶的表达量上调。越来越多的研究已经证明抑制Aurora激酶可以增强化疗。在过去的几十年里，一系列Aurora激酶抑制剂(AKIs)有效地抑制了许多癌症的发展和生长。这表明极光激酶可能是一种新的治疗靶点。

相比之下，植物中Aurora激酶的功能研究才刚刚开始。然而，通过遗传学、细胞生物学和生物化学方法已经发现植物中Aurora激酶在形成(不对称)分裂、染色质修饰和维持基因组的稳定性发挥重要作用，但不同Aurora激酶存在一定功能差异性。拟南芥中有三个Aurora激酶：AtAUR1、AtAUR2和AtAUR3。AtAUR1和AtAUR2为α-Aurora，功能类似。而AtAUR3为β-Aurora，定位与功能与其它两个成员都有不同。AtAUR3定位于分生组织细胞间期的细胞核，而分裂期定位于着丝粒，可能在染色体分离发挥作用。BY2细胞过表达AtAUR3导致异常的细胞分裂模式，包括分裂方向异常，纺锤丝形成存在缺陷等。

有丝分裂是真核生物最重要的生命活动，而水稻是我国主要的粮食作物，因此研究水稻中Aurora激酶的功能对水稻正常发育，确保产量以及抗逆都具有重要意义。水稻中Aurora激酶只有两个成员，α-Aurora和β-Aurora各一个，分别是OsAUR1和OsAUR2。目前为止，对水稻OsAUR2的功能研究几乎空白，而OsAUR2对应的突变体也并无发现。因此，敲除水稻中OsAUR2基因获得其突变体对分析其功能以及阐明水稻有丝分裂机制具有重要的作用。本发明通过设计sgRNA构建基因编辑载体、转基因技术和CRISPR-CAS9技术获得转基因植株、测序分析获得OsAUR2基因编辑(敲除)的植株及序列编辑情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲除水稻Aurora激酶基因OsAUR2的方法，提供了一种基于CRISPR-CAS9技术敲除水稻OsAUR2的sgRNA以及用于敲除水稻OsAUR2基因的载体。

使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsAUR2的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)选择OsAUR2基因编码区第36至55核酸序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列(SEQID NO.1)：GATCGGCAAGTACATCGGCG；

根据靶序列设计两条oligo DNA：

OsAUR2-F1(SEQ ID NO.2)：CAGGATCGGCAAGTACATCGGCG