[发明专利]一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法

说明书

本发明公开一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，涉及扩增基因序列技术领域。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。本方法使用信息学的方法拼接得到目的基因序列全长，两个引物都是基于基因已知片段设计，方法简单，提高扩展效率，保证扩增序列的准确性，有助于推动未知序列扩增技术的发展。

技术领域

本发明涉及扩增基因序列技术领域，具体涉及一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法。

背景技术

扩增基因序列是探明基因功能的基础。传统的扩增未知基因序列的方法主要通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)。它是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法。其原理是利用mRNA的末端的特殊序列，设计含有接头引物，与保守序列的特异引物扩增获得未知序列，再进行拼接，得到基因全序列。

RACE技术需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂。

发明内容

本发明的目的就是针对现有RACE技术存在的需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂的不足，提供一种基于转录组测序的简便快速获得未知序列片段的新方法。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列。以获取的基因序列为模板，设计引物，扩增目的基因条带。该方法简单方便，无需合成特殊引物，扩增效率高，准确性高，是未知序列扩增的有效方法。

本发明采用以下技术方案。

本发明提供一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。

进一步的，本发明的扩增基因全序列的方法包括以下步骤：

S1，用Trizol试剂或者RNAiso Plus试剂提取金线莲总RNA；

S2，以提取的金线莲总RNA为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，合成cDNA第一链；

S3，以cDNA第一链为模板，用cDNA第二链合成试剂盒(Second Strand cDNASynthesis Kit)合成cDNA第二链；

S4，对得到的cDNA第二链样品，建立cDNA文库，再进行总RNA测序，对测序数据过滤、组装和去冗余后获得金线莲Unigene序列，对金线莲Unigene序列进行功能注释；

S5，获取除金线莲外的其他兰科植物的基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，获取与所述其他兰科植物的基因序列相同功能的金线莲的基因序列，以所述金线莲的基因序列为模板，设计引物并扩增得到目的基因。

优选地，步骤S1具体包括：

(1)取金线莲植株，加液氮快速研磨成粉状，取50～150mg装入离心管，加入0.5～1.5mL RNAiso Plus，摇晃离心管使金线莲粉状样品与RNAiso Plus充分混匀后，静置5～15min；

(2)以10000～14000g的离心力，2～6℃条件下，离心5～15min，取离心后离心管中的上清液300～900μL，放置于新的离心管中；

(3)向放置上清液的试管中加入50～250μL氯仿，摇晃混匀，静置5～15min；

(4)以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min；