[发明专利]一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用

说明书

本发明公开了一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用。本发明所述的一种耐热型口蹄疫重组病毒株，命名为rM10，其是由SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA通过病毒拯救获得的。实验证明，该重组病毒株的衣壳完全裂解的温度比野生毒株病毒的高，表明该拯救获得的口蹄疫重组病毒株rM10比野生毒株更耐热。本发明的提出为进一步推进热稳定性疫苗的研究和应用，为重大疫病防控及彻底净化提供了技术支持。同时本发明的提出为制备稳定性口蹄疫疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种耐热型口蹄疫重组病毒株，还涉及由该病毒株制成的灭活疫苗及其应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染引起的猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的传染病之首。

口蹄疫的流行、暴发严重影响我国乃至全球畜牧养殖业发展及农畜产品的流通贸易，并造成巨大的经济损失。国家中长期动物疫病防治规划中将口蹄疫确定为首位限期免疫净化防控的病种。

目前为止，传统灭活疫苗免疫是口蹄疫防控的重要手段之一。口蹄疫病毒衣壳呈现热不稳定性，容易受温度及其他环境因素的影响。病毒的低稳定性导致其快速解离，使其免疫原性发生改变，从而降低了其作为疫苗而引起机体的免疫反应，限制其生产和应用，这也是目前商业化疫苗冷链运输和储藏的主要原因之一。但冷链运输和储藏费用在疫苗成本中占很大比重，因此，解决口蹄疫病毒及相应疫苗稳定性问题备受关注。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种耐热型口蹄疫重组病毒。

本发明的目的之二在于提供一种耐热型口蹄疫灭活疫苗及其制备方法。

本发明的目的之三在于提供所述的灭活疫苗在防治口蹄疫中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明将O型FMDV O/BY/CHA/2010细胞毒(GenBank Accession No：JN998085.1)在特定温度下灭活99.99％，将处理样品复苏至与原病毒液相似滴度后再反复多次处理，筛选出具有耐热性的病毒株(M3、M9、M10)，并进一步鉴定了与病毒衣壳热稳定性相关的关键氨基酸。结果显示，病毒经过反复热处理筛选后其完全灭活温度具有一定的提高，且筛选出的热稳定毒株的灭活百分比比野毒株低。PaSTRY试验(Particle Stability ThermalRelease Assay)进一步证实热稳定性毒株衣壳完全裂解的温度比野生(WT)毒株高。表明通过反复热处理后筛选到了具有一定耐热性的口蹄疫病毒。将野生毒株和突变毒株在37℃处理，发现突变毒株病毒滴度比野生毒株具有较慢的降解速率，其中在37℃下处理8h后突变毒株(M3、M10)与野生毒株差异最为明显。将相同滴度的野生毒株和突变毒株(M3、M10)在37℃下处理8h后用BEI进行灭活，灭活后三倍浓缩，再与等体积的ISA-206乳化后免疫豚鼠，结果显示突变毒株免疫的豚鼠相比于野生毒株免疫的豚鼠产生了更高的中和抗体及和特异性抗体，通过淋巴细胞增殖试验得知突变毒株免疫的豚鼠组淋巴细胞增殖更加明显；攻毒保护试验显示突变毒株免疫的豚鼠组相(免疫保护率：75％)比较野生毒株免疫的豚鼠组(免疫保护率：50％)具有更高的免疫保护率，进一步说明了使用筛选得到的耐热毒株作为灭活疫苗能够产生更高的免疫保护能力。为进一步确定突变位点对病毒的耐热性影响，通过反向遗传学技术构建了耐热性突变病毒株的感染性cDNA克隆，拯救出具有突变位点的突变毒株，并对拯救得到的突变毒株进行了耐热性分析，从而得到具有耐热性的突变毒株。