[发明专利]一种耐热型口蹄疫重组病毒株及其在制备口蹄疫灭活疫苗中的应用

权利要求书

1.一种耐热型口蹄疫重组病毒株，命名为rM10，其特征在于，所述的重组病毒株是由SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系后，通过病毒拯救获得的。

2.一种获得权利要求1所述的重组病毒株的方法，其特征在于是将含有SEQ ID NO.1所示的感染性cDNA的质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM10。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)目的片段扩增

根据原始病毒株的序列人工合成5'UTR的5’端596bp的片段，并在其5'端引入限制性内切酶Not I和锤头状核酶cDNA序列，3’端加入BtgZ I限制性酶切位点，将该片段命名为A片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-A，其中所述的A片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的原始病毒株为O型FMDV O/BY/CHA/2010株细胞毒，GenBank Accession No：JN998085.1；

合成丁型肝炎病毒的核酶cDNA，在其5’端引入Aar I限制型内切酶位点和32个Poly(A)，3’端加入EcoR V位点，将该片段命名为D片段，并克隆至pUC57载体，记为pUC-D，其中所述的D片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

通过RNA提取试剂盒提取原始病毒株的总RNA，分别用引物BR，CR，进行反转录扩增cDNA，随后再分别用引物对BF和BR扩增两端含Aar I的片段B，用引物对CF和CR扩增两端含BtgZ I的片段C，分别克隆到pMD18-T载体，分别记为pT-B、pT-C；

引物序列如下：

BF：CACCTGCCGTTTTCATGAGAAATGGGACG

BR：TTATTCACCTGCTTGGCTTCCTTGTACTTGGCCGGG

CF：GCGATGCAAGTACAAGGAAGCCAAGGAATG

CR：TGCGATGGACCATGAAGGGGATAAAGGAAACGGGAAAAGCCCT

(2)突变位点引入

按照碧云天生物技术的QuickMutation^TM基因定点突变试剂盒引入突变位点，具体如下：

以质粒pT-B为模板，用引物对M737F/M737R进行PCR扩增引入突变位点A737T，PCR反应结束后，直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI酶，混匀后37℃孵育5min，DpnI消化后取5-10μl转化DH5α感受态细胞常规方法涂板培养，挑取3-5个克隆测序，将突变位点正确质粒命名为pT-m10B；

引物序列如下：

M737F：GCT GAC CCC GTG ACTA CCA CCG TTG AGAATT

M737R：AATTCTCAACGGTGGTAGTCACGGGGTCAGC

(3)全长cDNA的构建

用限制性内切酶Not I和BtgZ I酶切pUC-A，回收A片段；用AarI酶切pT-m10B回收m10B片段；用BtgZ I酶切pT-C，回收C片段；用Aar I和EcoR V酶切pUC-D，回收D片段，分别用琼脂糖凝胶纯化，用T4 DNA连接酶将A、m10B、C、D四个片段连接为全长感染性cDNA，并克隆至pVAX的Not I和EcoR V位点，得到含有全长感染性cDNA克隆的重组质粒命名为prM10，其中所含有的全长感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(4)将prM10质粒转染稳定表达T7聚合酶基因的BHK-21细胞系中，获得拯救后的重组病毒株rM10。

4.权利要求1所述的耐热型口蹄疫重组病毒株在制备耐热型口蹄疫灭活疫苗中的用途。

5.一种耐热型口蹄疫灭活疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的耐热型口蹄疫重组病毒株以及佐剂组成。