[发明专利]DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白

说明书

DosH蛋白中提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白。本发明发现了一种提高蛋白有序性的氨基酸序列及该序列的几个关键突变位点。实验结果表明，通过对这些突变位点进行基因替换，分别得到的几个重组蛋白能够在逆境条件下保护酶的活性，并且可减少酶发生聚集，防止其结构发生改变。

技术领域

本发明涉及一种提高蛋白有序性的氨基酸序列以及相关的突变位点和重组蛋白及应用。

背景技术

冷冻和氧化等逆境是制约生物生长和发育的非生物胁迫因素，比如蛋白在逆境胁迫条件下往往会降低或失去活性。尤其是酶蛋白，容易发生聚集或结构的其它改变而失活。

因此，通过基因工程手段，得到能在逆境条件下保护蛋白活性的重组蛋白，很有必要。

发明内容

本发明的目的是通过提供一种提高蛋白有序性的氨基酸序列以及发现其相关的突变位点，得到具有抗逆保护功能的重组蛋白。

本发明发现，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的DosH蛋白在逆境胁迫条件下可保护酶的活性，并能减少酶发生聚集和阻止结构发生改变。

DosH蛋白由298个氨基酸组成，分子量为30.9kDa，富含亲水性氨基酸，亲水氨基酸含量为61％，是一类亲水蛋白。

本发明对DosH蛋白进行一级结构分析发现，与其它典型的亲水蛋白质比较，DosH蛋白显著的特点是含有一个有序性升高的多肽(SEQ ID NO.2；N-DosH：1-103位氨基酸)，为Deinococcus属特异序列，具有高度保守性，可能是DosH蛋白折叠成有序二级结构的关键区域。

本发明发现，在DosH蛋白中有几个关键位点，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)和赖氨酸(K)位点高度保守，且能够促成蛋白形成二级结构。

其中，亮氨酸(L)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)3种氨基酸能够促成蛋白形成有序二级结构；谷氨酸(E)和赖氨酸(K)促成蛋白形成无序二级结构。

本发明将DosH蛋白61位的W和75位的I突变为脯氨酸(P)，该突变蛋白命名为WIP(SEQ ID NO.3)；

将14-17位4个连续L、61位的W和75位的I突变为P，该突变蛋白命名为LWIP(SEQ IDNO.4)；

将6位的E、59位的K、62位的E突变为A，该突变蛋白命名为3A(SEQ ID NO.5)。

软件预测突变后的蛋白，与DosH蛋白相比，有序性从高到低依次为3ADosHWIPLWIP。

进一步利用圆二色谱技术测定DosH及突变蛋白二级结构的有序性，结果显示，3个蛋白的有序性分别为DosH：82.5％；WIP：62.2％；LWIP：51.4％，有序性与预测结果一致。

本发明表达了3A、WIP和LWIP重组蛋白，发现3个重组蛋白在逆境胁迫条件(液氮反复冻融和H₂O₂冲击)下都有不同程度对酶的保护作用，证实以上提到的几个位点是DosH蛋白的关键位点。

本发明进行的具体研究工作如下：

1、DosH、3A、WIP和LWIP重组蛋白表达载体的构建：

1)以本实验室保存的重组质粒pET28a-DosH为模板，通过PCR扩增出目的基因(DosH、3A、WIP和LWIP)；

2)将DosH、3A、WIP和LWIP基因连接于pET28a表达载体上，构建完整基因重组质粒pET28a-DosH、pET28a-3A、pET28a-WIP和pET28a-LWIP；