[发明专利]杆状病毒表达系统及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子，所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。利用本发明的杆状病毒表达系统，可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，特别是涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用。

背景技术

基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiplenuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的昆虫杆状病毒表达载体系统(BaculovirusExpression Vector System,BEVS)是一种可在昆虫细胞中大规模表达外源重组蛋白的最通用和最强大的真核表达系统之一，自1985年在该系统中首次实现IL-2蛋白的大规模生产以来便得到了广泛的应用。与其他重组蛋白表达系统相比，重组杆状病毒表达系统具有明显的优势：1)安全性高：宿主局限于特定的无脊椎动物，对哺乳动物和植物无致病性；2)易于扩大生产规模：可用初始得到的重组杆状病毒感染更多的昆虫细胞，从而获得更高的病毒滴度；3)高水平及可溶性表达：可实现外源蛋白的高水平表达，在大多数情况下，重组蛋白是可溶的，且易于从感染细胞中纯化回收；4)修饰及折叠的准确性：重组杆状病毒载体可利用昆虫细胞的翻译后修饰系统对外源蛋白进行正确的修饰及折叠，从而得到具有生物活性的重组蛋白；5)悬浮培养：现有的细胞系在悬浮培养中生长良好，因此可在大规模生物反应器中生产重组蛋白；6)低成本：昆虫细胞无血清培养大大降低了生产成本。

杆状病毒穿梭载体系统是目前应用最广泛的一种基于Tn7转座的BEVS克隆系统，也被称为Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统。该系统包括三个主要成分：1)杆状病毒穿梭载体，又称为Bacmid载体，含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点，可在大肠杆菌中进行复制增殖；2)辅助载体pHelper，表达Tn7转座酶；3)pFastBac供体载体，包含转座位点Tn7R和Tn7L，以及两者之间的庆大霉素抗性基因(Gen)表达盒和外源基因表达盒。Bacmid和辅助载体pHelper共存于DH10Bac菌株中，当克隆了外源基因的pFastBac转化到DH10Bac菌株后，辅助载体pHelper表达的转座酶可介导pFastBac载体上Tn7R和Tn7L的之间的区域转座到Bacmid中的mini-attTn7位点，然后通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆。

但是，利用传统的Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统所得到的表达外源基因的Bacmid DNA是一种混合的质粒，其中包含了供体载体、辅助载体、未转座的Bacmid载体以及重组阳性Bacmid载体。若直接用于转染昆虫细胞进行杆状病毒包装，污染质粒(供体载体和辅助载体)会以高达25％的非同源重组率整合到Bacmid病毒基因组中，引起病毒基因组的大片段缺失，并被包装到子代病毒颗粒中。同时，这也不利于计算杆状病毒包装过程中Bacmid DNA的精确加入量，导致包装体系非最优。虽然将转座重组产物提纯后重新电转感受态能够筛选得到纯化的菌株，然而该过程操作繁琐，耗时费力，大大降低了工作效率。

发明内容

基于此，有必要提供一种可快速直接得到高纯度重组Bacmid载体的杆状病毒表达系统。

一种杆状病毒表达系统，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子；所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。