[发明专利]一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养；

(2)选取步骤(1)培养后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，转移至预培养培养基中，黑暗倒置预培养3d；

(3)采用农杆菌介导法侵染步骤(2)预培养后的外植体；

(4)将步骤(3)侵染后的外植体转移至共培养培养基中，黑暗正置共培养2d；

(5)将步骤(4)共培养后的外植体转移至恢复培养基中，黑暗倒置培养2d，然后恢复正常光照并倒置培养直至长出不定芽；

(6)将步骤(5)中获得的不定芽转至筛选培养基中，继代培养2～3次；

(7)将步骤(6)继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；

(8)将步骤(7)得到的组培苗开瓶炼苗，后正常管理；

步骤(1)～(7)中所述的培养基的组成如下所示：

播种培养基：1/2MS培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.9；

预/共培养培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/LAgNO₃+100mM/L AS，pH 5.8；

侵染培养基：1/2MS培养基+20g/L蔗糖+100mM/L AS，pH5.7；

恢复培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/L AgNO₃+100mM/L AS+200mg/L TM，pH5.8；

筛选培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2mg/L AgNO₃+100mM/L AS+200mg/L TM+55.5μL/LPPT，pH5.8；

生根培养基：MS培养基+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+0.3mg/L NAA+2mg/LAgNO₃+100mM/L AS+200mg/L TM，pH5.8。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表面消毒的具体为：

选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，首先用无菌水冲洗2遍，然后用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍，最后用质量分数为7.5％的NaClO浸泡10min、无菌水冲洗3次并吸干水分。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的侵染的为10min。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的侵染的具体为：

将农杆菌扩摇后，4000rpm离心15min，弃上清液；用侵染培养基重悬农杆菌，将其光密度值OD₆₀₀调至为0.5～0.6，然后28℃、200rpm震荡培养4h，得到农杆菌侵染液；将外植体转移至农杆菌侵染液中，28℃、150rpm震荡侵染10min。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的共培养的具体为：

用漏勺过滤步骤(3)中侵染后的外植体，然后置于干净的滤纸上，将多余菌液吸干净；另取一张干净的滤纸平铺于共培养培养基上，用1～2ml侵染培养基打湿滤纸，将吸干净菌液的外植体至于其上，保证子叶柄切口接触滤纸；然后黑暗正置培养。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的外植体用无菌水清洗3～4遍，吸干多余水分，迅速转移至恢复培养基中，前2d黑暗倒置培养，之后倒置正常光照培养。

7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的菜心遗传转化方法，其特征在于：

步骤(6)中所述的不定芽的长度为1.0～2.0cm。