[发明专利]一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法

说明书

本发明涉及植物基因工程应用领域，具体涉及一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。本发明将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养，然后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，进行预培养、侵染、共培养、恢复培养和继代培养；将继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗，组培苗今后一步开瓶炼苗，后正常管理，得到转基因植物。本发明以菜心为材料，构建了菜心遗传转化体系，获得转基因植株，操作简单高效，污染率低，综合性能高，为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。

技术领域

本发明涉及植物基因工程应用领域，具体涉及一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。

背景技术

菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是华南地区栽培面积和产量最大的蔬菜。菜心以菜薹为主要食用器官，品质柔嫩，风味独特，营养丰富，受到广大消费者的喜爱；其适应性广，生长周期短，可供周年生产，在蔬菜供应中占有重要地位。

20世纪80年代之后，大白菜组织培养与植株的高频再生系统逐步建立，在此基础上进行的转基因研究也取得了一定的进展，但主要集中在白菜遗传转化上，菜心遗传转化成功的报道很少。预培养时间、侵染时间、侵染浓度、共培养时间及选择压等都会对菜心的遗传转化产生影响。

携带AA基因型的白菜类作物属于芸薹属再生率比较低的品种，其不定芽再生困难，农杆菌不易感染，影响了基因工程在白菜品种改良上的应用。随着白菜全基因组测序计划的完成，白菜开始成为十字花科植物功能基因组研究的模式植物。关于芸薹属植物基因和功能的研究越来越多，遗传转化体系的建立将为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法，包含如下步骤：

(1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养；

(2)选取步骤(1)培养后苗龄为3d的无菌苗的带柄子叶作为外植体，转移至预培养培养基中，黑暗倒置预培养3d；

(3)采用农杆菌介导法侵染步骤(2)预培养后的外植体；

(4)将步骤(3)侵染后的外植体转移至共培养培养基中，黑暗正置共培养2d；

(5)将步骤(4)共培养后的外植体转移至恢复培养基中，黑暗倒置培养2d，然后恢复正常光照并倒置培养直至长出不定芽；

(6)将步骤(5)中获得的不定芽转至筛选培养基中，继代培养2～3次；

(7)将步骤(6)继代培养后的不定芽转移至生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；

(8)将步骤(7)得到的组培苗开瓶炼苗，后正常管理；

步骤(1)中所述的表面消毒的具体操作优选为：

选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，首先用无菌水冲洗2遍，然后用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍，最后用质量分数为7.5％的NaClO(活性氯含量为4％)浸泡10min、无菌水冲洗3次并吸干水分；

步骤(3)中所述的侵染的时间优选为10min；

步骤(3)中所述的侵染的具体操作优选为：